酰基链稳定酰化结构域并决定百日咳腺苷酸环化酶毒素与细胞膜的受体介导相互作用机制

本研究针对百日咳杆菌腺苷酸环化酶毒素（CyaA）的酰化结构域（AD）在膜相互作用中的分子机制展开。通过构建系列截短蛋白（RTX719/770/1008等），结合圆二色谱、纳米差示扫描荧光及小角X射线散射（SAXS）技术，揭示了Ca2+驱动的RTX结构域折叠如何协同酰基链（K860/K983）稳定AD构象，并首次证明单个酰基修饰即可介导CR3受体依赖性膜锚定。该发现为RTX家族毒素的致病机制提供了新见解，发表于《Journal of Biological Chemistry》。

　　

百日咳杆菌分泌的腺苷酸环化酶毒素（CyaA）是典型的RTX（Repeat-in-Toxin）家族成员，通过补体受体3（CR3/CD11b/CD18）靶向吞噬细胞，引发致命性感染。其核心致病机制依赖于毒素分子上两个关键酰化位点（K860和K983）的棕榈酰化修饰，但酰基链如何协调毒素结构稳定性与膜插入功能始终是未解之谜。现有研究虽已解析RTX结构域的钙依赖性折叠特性，但对酰化结构域（AD）的动态构象变化及其与CR3受体的互作关系缺乏系统性认知。

为解决这一科学问题，来自捷克科学院等机构的研究团队Carlos Espinosa-Vinals等人开展了一项突破性研究。通过精巧设计AD-RTX嵌合蛋白与位点特异性突变体，结合多尺度结构生物学技术，首次阐明酰基链在AD构象稳定和CR3介导膜锚定中的双重作用机制。该成果发表于《Journal of Biological Chemistry》，为靶向RTX毒素膜相互作用界面的抗感染策略提供了理论依据。

研究团队主要运用四种关键技术：1）蛋白质工程构建AD-RTXa/b及单/双酰化突变体；2）圆二色谱（CD）监测钙离子诱导的构象转变；3）纳米差示扫描荧光（nanoDSF）分析热稳定性；4）在线尺寸排阻色谱耦合小角X射线散射（SEC-SAXS）解析溶液结构。

钙驱动RTX结构域折叠指导AD构象组装
通过对比AD-RTXa（缺失1个RTX九肽）与AD-RTXb（完整RTX重复）的CD谱，发现仅AD-RTXb在5 mM Ca²⁺下形成典型β-折叠（218 nm负峰），证实RTX重复的相位连续性对AD正确折叠至关重要。

AD的N端形成独立于钙离子的亚结构域
RTX719/770的热变性实验显示，N端（719-770残基）在EGTA处理后仍保留α-螺旋特征（205 nm负峰），而C端AD完全解折叠。纳米DSF进一步揭示该区域存在78°C和61°C双相熔解曲线，提示其作为自主折叠单元的功能。

酰基修饰调控AD结构紧密度
SAXS分析显示双酰化RTX719的旋转半径（R_g）仅3.76 nm，显著小于非酰化变体（4.51 nm）。距离分布函数（P(r)）证实酰基链使最大粒子尺寸（D_max）从17.8 nm缩短至14.5 nm，Kratky图表明酰化显著降低蛋白质柔性。

单酰基链足以介导CR3依赖性膜锚定
竞争结合实验表明，仅携带K860或K983单酰化的RTX719突变体即可有效抑制全长CyaA与CHO-CR3细胞的结合（IC₅₀≈20 nM），且双酰化RTX719的抑制效率比缺失N端α-螺旋的RTX770高3倍，证实AD的完整结构对膜相互作用至关重要。

这项研究系统阐释了CyaA毒素AD结构域的双重调控机制：一方面，Ca²⁺驱动的RTX β-roll组装从C端向N端矢量式传递，指导AD的β-折叠形成；另一方面，K860/K983连接的酰基链与N端α-螺旋结构域（推测具有酰基载体蛋白样折叠）互作，通过"闭合构象"稳定整体结构。尤为重要的是，单个酰基修饰即能满足CR3介导的膜锚定需求，这解释了临床分离株中K860突变体仍保持毒力的现象。

该发现不仅深化了对RTX毒素家族膜穿透机制的理解，更揭示了酰化修饰在蛋白质结构动力学中的普适性作用——除增加疏水性外，酰基链可通过构象选择机制精确调控蛋白质功能界面。研究建立的AD-RTX模块化分析体系，为开发干扰毒素膜插入的小分子抑制剂提供了新靶点。未来研究可进一步解析酰化AD与CR3的瞬时复合物结构，以及钙信号波动如何动态调控毒素构象转换。