马尿中违禁药物定量检测新突破：基于UHPLC-HRMS的生物分析方法开发与验证

本研究针对马术反兴奋剂检测中低浓度违禁药物定量难题，开发了超高效液相色谱-高分辨质谱联用（UHPLC-HRMS）方法，成功验证了地西泮（10 ng·mL?1）、酮洛芬（100 ng·mL?1）等7种物质的检测限与准确度。通过β-期望容忍区间统计模型，证实该方法符合ISO 17025标准，为赛事公平性与马匹福利保障提供关键技术支撑。

　　

在竞技体育的阴影下，马术运动长期面临兴奋剂滥用的严峻挑战。从古罗马战马到现代赛马，人类试图通过药物提升马匹性能的历史已延续千年。如今，随着违禁药物种类日益复杂化，传统检测技术难以应对pg级痕量物质的精准定量需求——这直接关系到赛事结果的公正性，更关乎马匹健康。当一匹赛马因0.1 ng·mL^?1的浓度差异被判定违规时，背后牵涉的不仅是巨额奖金归属，更是整个行业的公信力危机。

针对这一痛点，Hassan II农业与兽医研究所药理学实验室的Wafaa El-Ghaly团队在《Journal of Pharmacological and Toxicological Methods》发表创新成果。研究者聚焦马尿基质中7种典型违禁药物（包括阈值10 ng·mL^?1的地西泮和100 ng·mL^?1的酮洛芬），建立了一套基于超高效液相色谱-高分辨质谱（UHPLC-HRMS）的定量检测体系。通过引入β-期望容忍区间统计模型，该方法在±30%接受限下实现了66.7%未来测量值的可靠覆盖，为反兴奋剂检测提供了符合ISO 17025标准的解决方案。

关键技术路线包含三大核心：采用甲醇/二氯甲烷混合溶剂进行液液萃取以降低基质效应；通过内标法（同位素标记化合物）校正仪器波动；基于SFSTP指南设计五浓度点（如地西泮6-14 ng·mL^?1）验证方案。研究特别关注色谱分离度与质谱碎片离子比的稳定性，确保复杂生物基质中痕量物质的特异性识别。

【结果】
• 选择性：空白基质色谱图显示无干扰峰，所有目标物分离度>1.5
• 线性范围：7种药物R²>0.99，覆盖80-120%阈值浓度
• 精密度：日内/日间RSD<15%，符合FDA"4-6-λ"规则
• 准确度：β=80%时回收率92-107%，耐受区间完全落入±30%限值

【讨论】
该研究突破传统LC-MS/MS在分辨率上的局限，利用HRMS的高质量精度（<5 ppm）实现了同分异构体的区分。特别值得注意的是，通过调整β值（66.7%-90%）验证方法稳健性，发现当β>80%时部分药物耐受区间超出限值，提示需优化样品前处理流程。与GC-MS相比，该方法将咖啡因的检测灵敏度提升10倍，且避免了衍生化步骤带来的误差。

这项研究的意义不仅在于技术层面的创新——其建立的"准确度轮廓"评估模型为生物分析方法验证提供了新范式。从实践角度看，实验室现可依据β值动态调整质控策略：当检测结果接近阈值时自动启用更严格的β=90%标准，而在筛查阶段采用β=66.7%提高通量。这种智能化的质控理念，正在被国际马术联合会（FEI）纳入新版反兴奋剂指南。正如作者强调的，未来需重点解决长期样本稳定性问题，以应对跨国赛事中样本运输延时的挑战。