金纳米颗粒尺寸与形状依赖性内吞机制：基于HeLa细胞共聚焦显微成像的定量研究

这篇研究通过3D共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）结合图像分析技术，定量揭示了HeLa细胞对金纳米颗粒（AuNPs）的内吞作用呈现显著的尺寸（80/150 nm）与形状（球形vs海胆形）依赖性。研究发现150 nm球形AuNPs的内吞水平是80 nm海胆形颗粒的4倍，且时间动力学显示7小时达峰后伴随外排竞争现象。该方法为纳米药物载体设计提供了无标记、高分辨的定量评估新策略。

　　

摘要

研究采用3D共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）结合Fiji图像分析，系统评估了HeLa细胞对不同尺寸（80/150 nm）和形状（球形/海胆形）金纳米颗粒（AuNPs）的内吞动力学。荧光标记细胞膜（Cell Mask Deep Red）与散射光检测AuNPs的组合策略，实现了无标记定量分析。结果显示：150 nm球形AuNPs的内吞量是80 nm海胆形颗粒的4倍，且呈现时间依赖性增长，7小时达峰后略有下降；而海胆形颗粒则表现为平缓的摄取曲线。活细胞实验进一步验证了这一规律，但内吞总量显著低于固定样本。MTT和Live/Dead实验证实AuNPs生物相容性良好，为纳米医学应用奠定基础。

引言

纳米颗粒（NPs）与生物系统的相互作用研究对疾病防治（如肺癌、癌症光热治疗）和药物递送载体开发至关重要。金纳米颗粒（AuNPs）凭借其生物相容性、易功能化（如硫醇化学修饰）和光热转换特性，成为肿瘤治疗和血管生成调控的理想候选。本研究选用HeLa细胞模型，通过光学显微技术克服质谱法间接计数的局限，建立了一种基于散射信号的3D定量方法，可同步解析NPs空间分布与细胞结构关联。

实验方法

细胞培养与标记：GFP转染HeLa细胞在DMEM培养基（含10%胎牛血清）中培养，接种于多聚赖氨酸包被的盖玻片。商用AuNPs（Sigma-Aldrich/BBI Solutions）经动态光散射（DLS）表征粒径和Zeta电位，以不同稀释比（1:1000-1:3000）孵育1-8小时后固定。

成像与分析：Leica Stellaris8共聚焦显微镜（63×/1.40 NA油镜）采集三通道图像：GFP（488 nm激发）标记细胞质，Cell Mask Deep Red（638 nm）标记膜结构，580 nm反射光检测AuNPs。Fiji软件通过3D Objects Counter插件量化细胞内NPs数量，以积分密度排除聚集体干扰，统计采用ANOVA检验。

结果

形貌依赖性内吞：150 nm球形AuNPs在7小时出现内吞峰值（0.1 NPs/μm³），显著高于80 nm海胆形颗粒（0.01 NPs/μm³）。小尺寸球形颗粒（80 nm）虽呈现时间依赖性增长，但总量仅为大球体的1/3（图3）。

活细胞验证：活细胞实验中球形颗粒仍显示递增趋势，但整体内吞量降低，可能与代谢活动导致的动态平衡有关。

生物相容性：MTT显示150 nm球体组细胞活力>100%（增殖效应），Live/Dead检测证实24小时内死亡率<10%（图2）。Zeta电位分析表明球形颗粒（|30 mV|）分散性优于海胆形（-25 mV），后者存在轻度聚集倾向（图S1）。

讨论

与文献对比发现，球形AuNPs的内吞效率普遍高于异形颗粒（如棒状、星形），与细胞膜曲率能量屏障理论一致。时间动力学中7小时峰值的出现可能反映内吞-外排平衡的转变，而固定样本的峰值在活细胞中转为平台期，提示样本处理可能影响膜运输过程。本研究的散射成像策略相较STED超分辨技术更接近天然状态，但未来可结合MINFLUX技术提升亚细胞定位精度。

结论

该研究建立了一种基于光学散射的AuNPs定量内吞分析方法，揭示尺寸与形状对细胞摄取的协同调控：大尺寸球形颗粒更易被内化，而尖锐形貌可能通过增加膜弯曲阻力抑制摄取。这一发现为优化纳米药物载体设计提供了直接实验依据，同时无标记检测策略可扩展至其他纳米材料体系。