基于深度学习与实时条件刺激递送的双鼠共居笼内恐惧条件追踪技术及其在创伤后应激障碍研究中的应用

推荐：本研究针对创伤后应激障碍（PTSD）中感官线索诱发异常恐惧反应的核心症状，开发了一种结合开源软件与深度学习姿态估计的帕夫洛夫范式，实现了双鼠共居笼内条件刺激（CS）的伪随机递送及昼夜节律行为追踪。结果显示，恐惧条件化小鼠在熟悉环境中表现出CS依赖性冻结行为及消退学习，且雄性小鼠的基线惊跳反应（ASR）和恐惧增强惊跳（FPS）显著增强。该技术为研究PTSD的神经机制提供了新型生态学行为分析工具。

　　

背景与问题
创伤后应激障碍（PTSD）患者常对创伤相关感官线索产生过度生理反应，即使在安全环境中也是如此。然而，现有临床前研究多局限于单一动物的短期恐惧反应分析，缺乏对社交环境（如双鼠共居）和昼夜节律影响的探索。此外，传统行为范式难以实现长期、动态的恐惧行为追踪。这些局限阻碍了对PTSD神经机制的深入理解。

为解决这些问题，乔治华盛顿大学的研究团队开发了一种创新性技术平台，结合开源软件（Adaptive Cue Delivery, ACD）和深度学习姿态估计（DeepLabCut?），首次实现了双鼠共居笼内条件刺激的伪随机递送及多日行为追踪。相关成果发表于《Neurobiology of Stress》。

关键技术方法
研究采用8-10周龄C57/BL/6雌雄小鼠，通过帕夫洛夫恐惧条件化（20次CS/US配对）建立模型。ACD软件编程在居家笼中递送6kHz/75dB听觉CS（每日3次光照期+3次黑暗期），持续14天。行为分析整合了人工评分与DeepLabCut-SimBA?工作流，追踪鼻、耳、颈等6个体表标志点，通过速度阈值（5 mm/s）判定冻结行为。后续测试包括新颖环境恐惧表达、惊跳反射（ASR）和恐惧增强惊跳（FPS）。

研究结果

1. CS-evoked freezing behavior in pair-housed mice within the home cage
恐惧条件化组在居家笼首日即表现出显著CS诱发冻结（90-100%），非条件化组无反应。深度学习分析（左耳标志点）与人工评分高度一致（视频2），验证了多动物姿态估计技术的可靠性。

2. CS-evoked freezing across light-dark cycles
光照期（非活动相）冻结反应显著高于黑暗期（活动相），且雄性冻结持续时间更长。第6天后出现消退学习，雌性消退速度更快（第10天达平台期），揭示性别与昼夜节律的交互影响。

3. Deep learning-based pose estimation validation
DeepLabCut?+SimBA?工作流通过插值法修复遮挡帧数据，冻结判定准确率达人工评分水平（图3E-I）。该技术首次实现动态笼内背景下的多动物行为量化。

4. Persistence of CS-evoked freezing in a novel context
尽管居家笼内出现消退，小鼠在新环境中仍表现高冻结反应（恐惧恢复效应），且无性别差异，证实消退学习的场景依赖性。

5. Enhanced baseline and fear-potentiated startle in males
雄性恐惧条件化小鼠表现出基线惊跳（120dB噪声）和CS增强惊跳（FPS）反应提升，而雌性和对照组无变化。高架十字迷宫（EPM）测试未发现回避行为差异，提示惊跳增强与运动功能无关。

结论与意义
该研究建立了首个整合伪随机CS递送、居家笼视频追踪和深度学习分析的PTSD样行为范式，揭示以下机制：

1. 生态学行为分析：双鼠共居环境中，恐惧消退呈现性别与昼夜差异，雄性更易保留高警觉状态（惊跳增强）；
2. 技术突破：ACD软件+DeepLabCut?实现多日、多场景恐惧动态监测，为神经环路研究提供新工具；
3. 临床启示：恐惧恢复效应印证PTSD患者"安全环境恐惧泛化"症状，而性别特异性惊跳反应可能解释男性PTSD的高共病率。

未来可结合无线遥测（Turley et al., 2021）与ACD系统，探索恐惧记忆的神经内分泌-自主神经整合机制。该范式对开发靶向感官威胁处理的PTSD干预策略具有重要价值。