基于无细胞蛋白合成系统的"柱上转化"技术实现按需胰岛素生产

为解决全球胰岛素供应链垄断和可及性危机，研究人员开发了基于PUREfrex? 2.1无细胞蛋白合成(CFPS)系统的新型生产技术。通过优化分子伴侣FkpA/Skp组合表达可溶性前胰岛素，结合Ni-NTA柱上亲和层析与胰蛋白酶转化，在24小时内成功获得具有生物活性的desB30-胰岛素。该技术为分布式按需生产提供了创新解决方案，显著缩短传统生物反应器生产周期。

　　

全球糖尿病患病人数预计到2030年将达6.43亿，但当前96%的胰岛素市场被三大制药巨头垄断，导致中低收入国家胰岛素可及性低至55%，甚至美国也有130万患者因成本问题不得不减量使用。传统基于大肠杆菌或酵母的生物反应器生产需要复杂的下游处理，且供应链脆弱性在COVID-19疫情期间暴露无遗。这些现状亟需开发快速、分散化的新型生产技术。

马里兰大学等机构的研究人员在《New Biotechnology》发表的研究中，创新性地采用无细胞蛋白合成(CFPS)系统结合"柱上转化"技术，实现了24小时内从基因到活性胰岛素的高效生产。研究团队通过优化PUREfrex? 2.1系统中的分子伴侣组合，显著提高了前胰岛素的可溶性表达，并开发出将纯化与酶促转化整合在镍柱上的一步法工艺。

关键技术包括：1) 设计含His标签和酶切位点的前胰岛素基因构建体；2) 使用PUREfrex? 2.1系统进行无细胞表达，并筛选FkpA/Skp分子伴侣的最佳浓度；3) Ni-NTA亲和层析纯化结合柱上胰蛋白酶转化；4) HPLC-TOF-MS对产物进行分子量鉴定；5) 采用Western blot和考马斯亮蓝染色进行定量分析。

【PUREfrex? 2.1 Expression of Biosynthetic Proinsulin】
研究设计了His-R-IP前胰岛素构建体，包含N端六组氨酸标签、甘氨酸连接子和精氨酸酶切位点。在PUREfrex? 2.1系统中，单独添加100 μM Skp时获得最高单体产量35.1 μg/mL，而50 μM FkpA则使二聚体产量达309.3 μg/mL。有趣的是，两者联用反而降低产量，暗示分子伴侣间存在竞争作用。

【Purification and Conversion of Proinsulin into Insulin】
通过Ni-NTA柱捕获后，56%的前胰岛素被固定化。采用1:34(w/w)的胰蛋白酶进行2.5小时柱上转化，获得9.7%的desB30-胰岛素回收率。质谱分析显示产物分子量为5,717 Da，与理论值(5,713 Da)高度吻合，并检测到胰岛素-前胰岛素复合物(16,774 Da)。

【Protein Characterization of Insulin and Proinsulin】
HPLC-TOF-MS证实PUREfrex? 2.1表达的His-R-IP分子量为10,843-10,870 Da，保留起始甲硫氨酸。柱上转化产物经受体结合实验证实具有与天然胰岛素相当的生物活性。

讨论部分指出，该技术突破性在于：1) 通过无细胞系统绕过了传统生产中的细胞壁限制，使分子伴侣能直接接触新生肽链；2) 柱上转化工艺将多步纯化-酶切过程整合为单步操作；3) 估算每1.4 mg治疗剂量生产成本约0.73美元，接近传统工艺的0.94美元。研究还发现植物源ALiCE?系统能产生更高产量(320 μg/mL)，暗示不同CFPS平台的优化潜力。

这项研究为胰岛素生产提供了革命性的技术路线，其模块化设计特别适合集成到Bio-MOD等自动化生物制造平台。未来通过优化酶切效率、采用Strep-tag替代His标签、以及开发冻干保存工艺，有望实现真正的按需分布式生产，从根本上改变全球胰岛素可及性格局。