综述：利用荧光蛋白在骨骼肌中进行活性氧物种的体内先进测量技术

这篇综述系统评述了骨骼肌中活性氧（ROS）测量的前沿技术，重点探讨了基因编码荧光蛋白（如HyPer7和roGFP）在解析运动诱导的H2O2时空动态中的突破性应用。文章对比了传统方法（如DCFH、ESR）的局限性，强调了NADPH氧化酶（Nox2/4）和线粒体在ROS信号传导中的核心作用，并指出体内外实验环境（如氧分压差异）对研究结果的显著影响，为运动生理学和肌肉疾病研究提供了方法论指导。

　　

State of the Art In Vivo Reactive Oxygen Species Measurements in Skeletal Muscle Using Fluorescent Proteins

Abstract

骨骼肌收缩过程中活性氧（ROS）浓度的动态变化及其在细胞器和细胞内的分布规律，对理解运动训练、衰老和疾病状态下的肌肉可塑性机制至关重要。传统ROS检测方法因技术限制难以捕捉生理性ROS信号，而基因编码荧光蛋白（如HyPer和roGFP系列）的出现为实时、高分辨率的体内成像提供了革命性工具。

1. Introduction

ROS是氧衍生的高活性分子，包括超氧化物（O₂^-•）和非自由基（如H₂O₂）。它们通过氧化还原反应参与细胞信号传导，但过量会导致蛋白质、脂质和DNA损伤。骨骼肌作为高度可塑性组织，其ROS水平变化直接调控运动适应（如线粒体生物发生）和病理状态（如肌肉萎缩）。1978年Dillard首次发现运动与氧化应激的关联后，研究者陆续开发了电子自旋共振（ESR）、荧光探针等方法，但直到近年基因编码荧光蛋白的应用才实现亚细胞水平ROS动态的精确解析。

2. Methods used to measure ROS in skeletal muscle

2.1 氧化应激标志物
传统方法如硫代巴比妥酸反应物（TBARS）和8-羟基脱氧鸟苷（8-oxodG）通过检测ROS终产物间接反映氧化损伤，但缺乏特异性且易受样本处理干扰。

2.2 电子自旋共振（ESR）
可特异性检测自由基，但需组织匀浆且无法反映瞬时ROS变化。1982年Davies首次用ESR证实运动后骨骼肌ROS升高，但超生理氧环境可能夸大结果。

2.3 荧光探针

• DCFH：最常用但非特异性，易受pH和氧浓度影响，且不可逆积累信号。
• DHE：特异性检测O₂^-•，但高浓度具有细胞毒性。
• MitoSOX：靶向线粒体O₂^-•，但可能干扰呼吸链功能。

2.4 荧光蛋白

• roGFP2-Orp1：通过二硫键可逆变化实现H₂O₂特异性检测，证实收缩主要升高胞浆而非线粒体H₂O₂。
• HyPer7：最新升级版灵敏度提高30倍，pH稳定性增强，体内实验显示运动后H₂O₂仅升高6%，远低于体外结果。

3. Changes in ROS levels due to exercise

3.1 线粒体
传统认为运动时线粒体是ROS主要来源，但新证据表明其ROS输出在状态3（高ATP合成）时反而降低。roGFP2-Orp1数据显示1Hz电刺激20分钟后线粒体H₂O₂无显著变化。

3.2 NADPH氧化酶（Nox）
Nox2（产O₂^-•）和Nox4（直接产H₂O₂）是运动诱导ROS的关键酶。p47phox-roGFP融合蛋白证实Nox2在拉伸和电刺激中激活，而Nox4敲除小鼠运动后线粒体适应性消失。

4. Skeletal muscle adaptations

运动诱导的ROS通过激活Nrf2/抗氧化反应元件（ARE）通路促进抗氧化酶表达，而Nox2抑制会削弱训练引起的线粒体网络形成。有趣的是，线粒体靶向抗氧化剂MitoQ反而增强PGC1α表达，提示不同ROS来源的差异化调控。

5. 体内外实验差异

5.1 氧分压影响
体外95% O₂环境（PO₂ >600 Torr）使ROS水平虚高，而体内肌细胞PO₂仅2-30 Torr。心脏骤停模型显示缺血20分钟即引起H₂O₂升高30%。

5.2 收缩功能
体外实验显示抗氧化剂可恢复降低的Ca²⁺敏感性，而体内实验表明生理性ROS轻微升高反而增强收缩功能，30秒强直收缩仅引起6% H₂O₂变化且不影响张力。

6. Future Prospects

6.1 亚细胞H₂O₂扩散
最新数据显示线粒体基质H₂O₂需硫氧还蛋白还原酶（TRR）抑制才能扩散至胞浆，而肌浆网Nox4产生的H₂O₂动态尚未明确。

6.2 技术挑战
现有探针对体内微弱ROS变化灵敏度不足，且肌肉收缩导致运动伪影需FRET探针解决。腺相关病毒（AAV）载体可提高荧光蛋白转染效率至90%以上。

7. Summary

基因编码荧光蛋白技术正重塑骨骼肌ROS研究范式，未来需结合更灵敏的探针和精准的亚细胞定位，揭示运动适应中ROS时空编码的生物学逻辑。