基于超支化滚环扩增技术的通用型一体化生物传感器实现核酸的高灵敏定量定性检测

为解决临床诊断中核酸定量定性检测对高灵敏度、高特异性和操作简便性的迫切需求，研究人员开发了一种基于超支化滚环扩增(HRCA)的一体化生物传感器。该技术通过优化检测组件（包括锁式探针、引物和分子信标MB），实现了1 fM-0.1 nM的宽线性范围检测，可区分单碱基差异，并在细胞、咽拭子和血浆样本中验证了其临床适用性。这项发表于《Sensing and Bio-Sensing Research》的研究为分子诊断提供了新型通用平台。

　　

在分子诊断领域，核酸作为遗传信息载体已成为癌症和传染病的关键生物标志物。然而现有检测技术面临两大挑战：一是同源序列干扰导致特异性不足，二是生物样本中靶标丰度极低（如microRNA仅22个核苷酸）。传统实时定量PCR(RT-PCR)虽可靠但依赖精密仪器和专业操作，而现有等温扩增技术如滚环扩增(RCA)又存在步骤繁琐、易污染等问题。如何建立兼具高灵敏度、单碱基分辨力和操作简便的一体化检测平台，成为临床转化的关键瓶颈。

针对这一难题，来自河南省儿童医院郑州儿童医院等机构的研究团队在《Sensing and Bio-Sensing Research》发表创新成果。研究人员设计出基于超支化滚环扩增(HRCA)的通用型生物传感器，通过四项关键技术突破实现"样本进-结果出"的一体化检测：1) 采用热激活Bst II Pro DNA聚合酶与T4连接酶协同体系，实现连接-扩增反应单管完成；2) 自主开发软件筛选检测组件，确保与人基因组相似度<75%且无二级结构；3) 优化分子信标(MB)熔解温度(T_m≈65°C)与聚合酶工作温度匹配；4) 构建包含锁式探针、正向/反向引物和MB的检测体系，通过靶标互补区(Tc)替换即可实现多靶标检测。

3.1 一体化HRCA生物传感器设计原理
传统HRCA需分三步进行（识别连接→信号放大→输出），而新方案通过MB探针在实时PCR仪上实现单管操作。当靶核酸与锁式探针Tc区结合后，T4连接酶将其环化，随后Bst II Pro聚合酶以正向引物启动线性RCA，产物触发MB构象变化产生荧光；反向引物进一步引发HRCA形成网状扩增产物，使信号指数级增强。原子力显微镜(AFM)观测证实，靶标存在时确实形成特征性网状结构。

3.2 关键技术参数优化
系统筛选发现T4连接酶与Bst II Pro聚合酶组合效率最高，缓冲液最佳配比为7:3。锁式探针Tc区T_m值优化至55°C时连接效率最大，62°C为最佳扩增温度。分子信标性能测试显示，MYCN-MB和NAGK-MB的检测点分别为63.3°C和68.1°C，与聚合酶工作温度完美匹配。

3.3 灵敏度与重复性验证
对MYCN和NAGK的检测线性范围达1 fM-0.1 nM，检测限较线性RCA(LRCA)提升10⁴倍。五批次重复实验相对标准偏差(RSD)为1.38%，不同操作者间RSD为1.94%。在10倍稀释人血清中添加标准品，回收率达97.67%-104.3%。

3.4 卓越的特异性表现
该传感器可清晰区分单碱基错配序列。在肺炎支原体(MP)检测中，能特异性识别MP DNA/RNA，与肺炎链球菌(SP)、腺病毒(ADV)等常见病原体无交叉反应。

3.5 真实样本验证
应用于神经母细胞瘤(NB)诊断时，成功量化SK-N-BE(2)细胞中MYCN/NAGK拷贝数比(M/N=71)，而正常细胞M/N<2。6例NB患者血浆检测结果与RT-PCR完全一致，证实其临床可靠性。

这项研究通过创新性的一体化设计，将HRCA检测时间缩短至120分钟内，且无需开盖操作，显著降低污染风险。其通用性平台特性使其既能用于病原体定性诊断（如MP感染），又能实现肿瘤标志物定量分析（如MYCN扩增检测）。尽管目前仍依赖PCR仪器，但该技术为开发便携式检测设备奠定了坚实基础，未来通过结合侧流层析等技术，有望推动分子诊断向基层医疗和现场检测场景拓展。作者团队特别指出，该传感器在儿童神经母细胞瘤和呼吸道感染诊断中的成功应用，彰显了其在精准医疗和传染病防控中的双重价值。