扫描电化学显微镜原位可视化监测抗菌胁迫下细菌生物膜的代谢活性响应

针对生物膜对抗菌剂的顽固耐药性难题，中国研究人员创新性地将扫描电化学显微镜(SECM)与刃天青(resazurin)氧化还原探针联用，建立了非破坏性、高时空分辨的生物膜代谢活性监测平台。该技术成功量化了环丙沙星和苯扎溴铵作用下大肠杆菌和铜绿假单胞菌生物膜的代谢异质性，为抗菌剂筛选和作用机制研究提供了新工具。

　　

在微生物世界中，细菌生物膜如同坚固的城堡，其分泌的胞外基质构成物理屏障，内部复杂的群体感应(Quorum Sensing, QS)系统形成化学防御网络，使得这类结构化菌群对抗菌剂的耐药性可达浮游菌的千倍。传统通过菌落计数(CFU)或荧光染色评估抗菌效果的方法，往往需要破坏生物膜结构，无法反映真实的生理状态。更棘手的是，现有基于葡萄糖消耗或胞外电子传递(EET)的检测手段，或受限于菌种特异性，或仅能反映局部代谢，难以全面评估生物膜的整体代谢活性。

针对这些技术瓶颈，中南大学的研究团队在《Sensors and Actuators B: Chemical》发表创新成果，将扫描电化学显微镜(SECM)与刃天青氧化还原探针相结合，开发出可原位、动态监测生物膜代谢活性的新方法。研究选用能穿透细胞膜的刃天青作为代谢指示剂，其被活细胞内的还原酶逐步转化为试卤灵(resorufin)和二氢试卤灵(dihydroresorufin)的过程，通过SECM微电极在-0.6 V电压下精准捕获氧化还原电流。为克服传统检测中氧气干扰导致的荧光信号偏差，该方法直接监测刃天青消耗量，显著提升了检测准确性。

关键技术包括：1）制备碳纤维微电极实现μm级空间分辨；2）构建海藻酸盐水凝胶生物膜微阵列保证样本均一性；3）SECM线扫描技术实现批量样品高通量检测；4）三维成像解析代谢活性空间分布。研究对象选取临床常见的革兰阴性菌——大肠杆菌(E. coli)和铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)，分别用抗生素环丙沙星(ciprofloxacin)和消毒剂苯扎溴铵(benzalkonium bromide)处理。

碳盘SECM探头的制备
通过水平微电极拉制仪制备尖端直径约7 μm的碳纤维微电极，其稳定响应刃天青还原电流，信噪比达15:1，为高灵敏度检测奠定基础。

基于SECM的刃天青还原分析法
研究发现，50 μM刃天青在PBS(pH 7.4)中产生稳定扩散电流(1.5 nA)，被生物膜代谢消耗后电流衰减程度与活菌量呈线性相关(R²>0.99)。相比传统MTT法，该方法检测限降低10倍，且能区分0.5 μg/mL浓度梯度下的药效差异。

抗菌剂作用模式解析
SECM成像清晰显示：环丙沙星处理6小时后，E. coli生物膜边缘代谢活性下降40%，而P. aeruginosa中心区域保持高活性，揭示了两者耐药性差异的空间特征。动态监测则发现苯扎溴铵使两种生物膜在2小时内代谢完全抑制，符合季铵盐类消毒剂的快速杀菌特性。

该研究建立的SECM检测策略，首次实现了非破坏性、全菌种适用的生物膜代谢活性定量评估。通过揭示抗菌剂作用的空间异质性和时间动力学特征，不仅为优化抗菌方案提供了新工具，更深化了对生物膜耐药机制的理解。特别是刃天青电化学检测路径的设计，有效规避了传统光学方法受氧干扰的缺陷，为活体微生物分析开辟了新思路。研究团队指出，该方法未来可拓展至多菌种混合生物膜及宿主-微生物互作研究，在慢性感染治疗和工业防腐领域具有广阔应用前景。