凝乳源发酵乳杆菌细菌素的广谱抗菌活性研究：分子对接与MM-GBSA结合自由能计算揭示其作用机制

本研究针对抗生素耐药性(ARPB)问题，从凝乳中分离出具有益生特性的Limosilactobacillus fermentum LMEM22菌株，通过体外实验结合分子对接和MM-GBSA(分子力学-广义玻恩表面积)结合自由能计算，证实其产生的13.1 kDa细菌素对革兰阴性菌(如Acinetobacter baumannii)和革兰阳性菌(如Staphylococcus aureus)均具有显著抑制活性(ZDI 17-24 mm，MIC 41-199 μg/ml)，并阐明其通过靶向SrtA和ExtA蛋白发挥作用的分子机制，为开发新型抗菌制剂提供理论依据。

　　

抗生素耐药性(AMR)已成为全球公共卫生的重大威胁，世界卫生组织(WHO)将包括大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)在内的多种细菌列为"优先病原体"。传统抗生素的失效促使科学家将目光转向天然抗菌物质，其中乳酸菌(LAB)产生的细菌素因其安全性(GRAS认证)和高效性备受关注。然而，细菌素作用机制的阐明仍存在技术瓶颈，特别是缺乏对靶蛋白相互作用的结构生物学研究。

为应对这一挑战，来自某大学的研究团队从市售凝乳中分离鉴定出一株具有益生特性的Limosilactobacillus fermentum LMEM22菌株，通过整合体外抗菌实验与计算机辅助药物设计(CADD)技术，系统研究了其细菌素的抗菌活性及分子机制。相关成果发表在《In Silico Research in Biomedicine》期刊，为开发新型抗感染制剂提供了重要理论依据。

研究采用16S rRNA基因测序鉴定菌株，通过生理应激(胆盐、低pH)耐受性实验评估益生特性，采用硫酸铵沉淀结合SDS-PAGE分离纯化细菌素。抗菌活性通过琼脂扩散法(ZDI)和肉汤稀释法(MIC)测定，并利用CABS-dock进行蛋白-肽分子对接，通过HawkDock服务器计算MM-GBSA结合自由能。

分子鉴定与益生特性
16S rRNA基因序列分析(MH380182)证实该菌株为Limosilactobacillus fermentum，系统发育树显示其与KM214424菌株亲缘最近。该菌株表现出典型益生特性：γ-溶血性、无明胶酶和DNA酶活性，可耐受2-6.5% NaCl、pH 2-4的酸性环境及0.125-0.5%胆盐。

细菌素特性与抗菌活性
SDS-PAGE显示细菌素分子量为13.1 kDa，产量1.656 mg/ml。对革兰阴性菌(A. baumannii等)的ZDIs为9-23 mm，MICs为50-199 μg/ml；对革兰阳性菌(S. aureus等)的ZDIs为17-24 mm，MICs为41-132 μg/ml。统计学分析显示两组抗菌活性无显著差异(p>0.05)。蛋白酶K和胰蛋白酶处理使抗菌活性降低13.04-29.41%，证实其蛋白质本质。

分子机制研究
分子对接显示细菌素J32(序列CTPRGCFGASVVKVVPSFMTD)与S. aureus的Sortase A(SrtA)和P. aeruginosa的Exotoxin A(ExtA)形成稳定复合物。ExtA_J32复合物通过6个常规氢键(如Tyr481-OH...Met19-O，2.57 ?)和盐桥(Arg458...Asp21)等相互作用，获得-70.35 kcal/mol的结合自由能；SrtA_J32复合物则通过1个常规氢键(Val14-N...Tyr75-OH，2.66 ?)等作用，结合自由能为-49.9 kcal/mol。能量分解分析发现Thr20、Phe7等关键残基对结合能贡献显著。

这项研究首次通过实验与计算相结合的方式，阐明L. fermentum细菌素通过双重靶向机制抑制病原菌：既可直接杀伤细菌细胞，又能特异性结合SrtA和ExtA等毒力因子。特别是发现其对P. aeruginosa ExtA的抑制活性更强，这为治疗难治性铜绿假单胞菌感染提供了新思路。尽管仍需临床验证，但该细菌素在食品防腐和抗感染治疗领域展现出良好应用前景，符合"One Health"理念下对抗AMR的战略需求。