基于TR-FRET高通量筛选技术开发靶向FAK FAT结构域的小分子抑制剂及其在癌症和纤维化治疗中的应用

推荐：研究人员针对FAK-paxillin蛋白互作(PPI)在癌症和纤维化中的关键作用，开发了基于时间分辨荧光共振能量转移(TR-FRET)的高通量筛选(HTS)平台。通过优化生物素化肽探针biotin-PEG-1907，成功筛选出4个特异性抑制FAT:paxillin互作的小分子化合物(IC50 7.2-62.6 μM)，并建立SPR验证体系。该研究为靶向FAK非激酶功能域的药物开发提供了新策略。

　　

黏着斑激酶(FAK)作为非受体酪氨酸激酶，在多种癌症中过表达并与不良预后密切相关。传统靶向FAK激酶结构域的ATP竞争性抑制剂在临床试验中表现有限，且无法完全抑制FAK的支架功能。越来越多的证据表明，FAK通过C端黏着斑靶向(FAT)结构域与paxillin等蛋白的相互作用，在肿瘤转移、纤维化进程中发挥关键作用。这促使科学家们将目光转向靶向FAK FAT结构域的新策略。

美国亚利桑那大学等机构的研究团队在《SLAS Discovery》发表重要成果，开发了首个靶向FAK FAT:paxillin蛋白互作(PPI)的高通量筛选平台。研究团队创新性地将烃链钉合肽UA-1907改造为生物素化探针biotin-PEG-1907，建立了384孔板TR-FRET检测体系(Z'值0.75-0.83)。通过筛选31,636个小分子化合物，结合CD47:SIRPα反筛选和表面等离子共振(SPR)验证，最终获得4个特异性FAT结合分子，其中UA-0005,790表现出最佳结合亲和力(K_D 6.2 μM)。该研究为开发靶向FAK支架功能的新型抗癌/抗纤维化药物奠定了基础。

关键技术包括：1) 设计合成含PEG连接臂的biotin-PEG-1907探针；2) 建立基于抗6his-Terbium/链霉亲和素-XL665的TR-FRET检测系统；3) 开发CD47:SIRPα TR-FRET反筛选体系；4) 采用SPR技术验证化合物与FAT结构域的直接结合。

【3.1. Design of biotin-peg-1907 probe】
研究团队基于前期开发的烃链钉合肽UA-1907(K_D 800 nM)，通过点击化学引入PEG7间隔臂和生物素标签，获得TR-FRET探针biotin-PEG-1907。SPR验证显示其保持对FAT结构域的纳摩尔级结合力(K_D 364 nM)，为后续筛选奠定基础。

【3.2. TR-FRET assay development】
通过交叉滴定实验确定50 nM 6his-FAT和300 nM biotin-PEG-1907为最佳检测浓度，采用抗6his-Terbium(0.67 nM)/链霉亲和素-XL665(15.6 nM)荧光对建立检测体系。未标记UA-1907的竞争实验证实体系特异性(IC₅₀ 4.4 μM)。

【3.4. HTS and hit validation】
筛选四类化合物库(31,636个分子)获得240个初筛阳性分子，经剂量反应测试和反筛选后，4个化合物(UA-0012,582/1528/1451/05790)显示出特异性抑制活性，IC₅₀介于7.2-62.6 μM。

【3.5. SPR validation】
SPR结合实验证实4个化合物直接结合FAT结构域，UA-0005,790亲和力最佳(K_D 6.2 μM)，验证了TR-FRET筛选结果的可靠性。

这项研究首次建立了靶向FAK FAT:paxillin PPI的高通量药物发现平台，其创新性体现在：1) 开发了基于钉合肽的TR-FRET探针；2) 构建了严谨的三重验证体系(初筛-反筛选-正交验证)；3) 获得的首批小分子抑制剂为后续结构优化提供了起点。特别值得注意的是，靶向FAT结构域的抑制剂有望克服现有FAK激酶抑制剂的局限性，通过破坏FAK的支架功能而非激酶活性，更有效地抑制肿瘤转移和纤维化进程。该研究不仅为癌症和纤维化治疗提供了新思路，也为其他"难成药"PPI靶点的药物开发提供了技术范本。