声波喷射质谱技术：高通量筛选共价BTK抑制剂的集成化创新平台及其在反应性与效力分析中的应用

本研究针对共价药物开发中传统质谱技术通量低、样本消耗大等问题，创新性整合声波喷射(AE)与高分辨飞行时间质谱(TOF-MS)，建立了自动化超高通量筛选平台。研究人员以布鲁顿酪氨酸激酶(BTK)为模型，成功筛选8000种共价化合物，结合谷胱甘肽(GSH)反应性分析和kinact/Ki动力学测定，实现了从初筛到活性评估的一站式解决方案，为靶向"不可成药"蛋白提供新范式。

　　

在药物研发领域，共价药物因其能靶向传统认为"不可成药(undruggable)"的蛋白质而备受关注。这类药物通过共价键与靶蛋白结合，具有作用持久、选择性高等优势，如已上市的BTK抑制剂伊布替尼和KRAS(G12C)抑制剂Sotorasib。然而，共价药物的开发面临三大技术瓶颈：传统质谱技术检测速度慢（LC-MS需2-5分钟/样本）、固相萃取质谱(SPE-MS)通量有限（5-30秒/样本），以及难以实现超高通量筛选所需的秒级分析。

为解决这些挑战，研究人员开发了基于声波喷射质谱(Acoustic Ejection Mass Spectrometry, AE-MS)的创新平台。该技术通过将SCIEX Echo? MS+与ZenoTOF 7600质谱仪联用，结合开放式接口(OPI)的千倍稀释功能，可直接将纳升级蛋白样品从1536孔板导入离子源，实现1-2秒/样本的超快速分析。研究以布鲁顿酪氨酸激酶(BTK)的Cys481为靶点，建立了一套涵盖初筛、反应性分析和效力评估的完整流程。

关键技术包括：1）优化缓冲体系，确定50 mM Tris-HCl/50 mM NaCl/1 mM TCEP为最佳检测条件；2）开发自动化工作流整合HighRes Biosolutions机器人系统；3）建立4倍甲酸稀释法实现样本在线淬灭；4）采用多孔板格式（384/1536孔板）实现纳升级样本处理；5）通过伪一级动力学方程计算GSH反应半衰期和k_inact/K_i值。

研究结果部分显示：在缓冲优化中，AE-MS对除SDS外的去污剂和添加剂具有良好耐受性，最低检测限达375 nM（11 fmol BTK）。筛选8000种丙烯酰胺化合物（含1978个片段）时，发现412个阳性命中（5.2% hit率），其中27个片段和25个先导物同时满足>50% BTK修饰和GSH t_1/2>3000分钟的标准。通过k_inact/K_i测定，最终确认4个高活性分子（如hit#1的k_inact/K_i=153.4 M^-1s^-1），其效力接近临床药物依鲁替尼（804.3 M^-1s^-1）。

这项研究的突破性在于：首次实现从初筛到动力学的全流程自动化，将传统需数周的流程压缩至7天内完成；建立的1536孔板工作流使单次实验蛋白消耗低于3 mg；开发的GSH反应性多路检测技术可同时评估1152个样本。这些进展为共价药物开发提供了标准化评估框架，特别有助于KRAS、EGFR等难靶蛋白抑制剂的发现。论文发表于《SLAS Technology》，展示了质谱技术在药物筛选中的变革性应用前景。