基于3D打印硬件的自动化中尺度蛋白质组学样品制备系统开发与性能评估

针对蛋白质组学样品制备自动化程度低、成本高昂的问题，本研究通过开发3D打印硬件模块，适配Andrew Alliance移液机器人，实现了中尺度（meso-scale）下溶液内消化（in-solution digestion）、S-Trap消化和Tip-based脱盐等关键步骤的自动化。结果显示自动化方法重现性优异（CV≤20%的蛋白质占比60%），虽回收率较手动降低33%-57%，但通过增加上样量可弥补差异。该方案为研究实验室和核心设施提供了低成本（<$30万）、高兼容性的自动化解决方案，发表于《Talanta Open》。

　　

蛋白质组学研究已成为解析复杂生物系统的核心手段，但样品制备环节却长期面临"自动化荒漠"的尴尬境地。传统手动操作不仅耗时费力，还容易引入人为误差；而市售高通量自动化工作站虽能提升效率，但动辄30万美元以上的价格和96/384孔板格式的刚性要求，让许多中尺度（meso-scale，日均处理<20样本）的研究实验室望而却步。这种矛盾在核心设施中尤为突出——不同课题组提交的样本批量差异大（如12例vs 6例），使得标准化自动化难以实施。更棘手的是，长达60-90分钟/样本的液相色谱梯度，从根本上限制了质谱分析通量，导致昂贵的自动化设备常处于"大材小用"状态。

针对这一困境，Champion实验室独辟蹊径，选择商业化Andrew+移液机器人（成本显著低于传统工作站）作为基础平台，通过创新性设计3D打印功能模块，开发了一套灵活适配中尺度需求的自动化解决方案。研究团队采用聚对苯二甲酸乙二醇酯（PETG）材料打印出可兼容单个S-Trap过滤器的96孔板适配器，并优化了移液程序以模拟手动操作的混合与回收步骤（如通过慢速反复吸打替代离心）。为验证系统性能，实验以大肠杆菌（E. coli）裂解液为模型，平行比较了自动化与手动方法在三大关键环节的表现：溶液内消化、S-Trap膜上消化和C₁₈ ZipTip脱盐。

关键技术方法包括：1）基于AutoCAD设计的3D打印S-Trap适配器；2）Andrew+机器人程序化控制移液步骤；3）UHPLC-MS/MS（超高效液相色谱-串联质谱）数据采集；4）PEAKS DB软件进行肽段/蛋白质鉴定；5）无标记定量（LFQ）分析回收率差异。样本队列为实验室自备的E. coli裂解液，通过珠磨法破碎制备。

In-solution Digestion
自动化方法虽重现性更优（60%蛋白质CV≤20% vs 手动52%），但肽段和蛋白质鉴定数分别减少34.1%和19.3%。线性回归显示二者丰度高度相关（R²>0.8），而LFQ定量揭示33%的回收率损失。通过增加33%上样量，自动化结果可与手动相当，证实差异主要源于管壁吸附等物理损耗而非系统偏差。

S-Trap Digestion
3D打印适配器成功实现单个过滤器处理，自动化与手动结果共享96%蛋白质。尽管肽段鉴定数下降36.8%，但关键性能指标如蛋白质CV（61%≤20%）与手动（63%）相当。值得注意的是，低丰度肽段在自动化组更接近检测限（Log₁₀[LFQ]≈2），再次印证回收率是主要限制因素。

Tip-Based Desalting
针对最易出错的脱盐环节，研究创新性引入水洗步骤消除交叉污染。虽然自动化回收率骤降57%，但其成功去除尿素干扰（MALDI-TOF验证），且操作一致性优于人工（57%蛋白质CV≤20% vs 手动49%）。

这项研究的意义在于首次证明：通过3D打印硬件改造，低成本机器人可胜任蛋白质组学制备的关键步骤，特别适合非样本受限的质控（QA-QC）研究。其模块化设计允许实验室根据需求灵活组合流程，而开源共享的STL文件（GitHub可获取）进一步降低了技术门槛。尽管在微量样本处理上仍有局限，但该系统为中尺度实验室提供了"够用就好"的自动化选择，有望减少人为误差带来的批次效应，促进跨实验室数据可比性。未来通过优化表面处理（如低吸附材料）和集成在线监测，或可进一步提升回收率，拓展其在精准医学等领域的应用前景。