综述：分子制图师工具包：绘制RNA未知领域的图谱

这篇综述系统梳理了RNA分子互作研究的技术革新，重点介绍了RNA-蛋白质互作（RBP）捕获技术（如TREX、SHIFTR）和邻近标记技术（PL，如APEX-seq、μMAP-seq），为解析RNA在细胞内的多层次互作网络（10-100 ?至10-100 nm尺度）提供了分子工具包，推动了对RNA调控网络“分子语法”和相分离（LLPS）介导的区室化功能的认知。

　　

引言

RNA分子通过与蛋白质、其他RNA及细胞微环境的动态互作调控其生命周期和功能。然而，由于RNA的高电荷性和易杂交特性，传统方法难以精准捕获其互作网络。近年来，分子制图技术的突破为探索RNA的未知领域提供了全新视角。

RNA-centric方法：直接互作发现

亲和标记技术通过MS2-MCP等系统捕获RNA结合蛋白（RBP），但存在转基因干扰和假阳性问题。例如，incPRINT技术通过荧光定量避免了质谱（MS）分析，但需基因工程改造RNA标签。

全局RNA互作捕获（RIC）利用紫外交联（UV-crosslinking）和相分离（如OOPS）富集全转录组RBP，但无法靶向特定RNA。反义寡核苷酸（ASO）下拉技术（如CHART-MS）通过DNA探针捕获内源RNA互作组，但需大量细胞输入。

区域特异性分析的突破来自TREX和SHIFTR技术，结合RNase H靶向切割和相分离，首次实现活细胞内特定RNA区域的互作蛋白鉴定。例如，TREX成功应用于核糖体RNA前体和病毒RNA研究。

区室化分析：邻近标记技术革新

酶催化策略：

• 生物素连接酶（TurboID）通过间接捕获（如核糖体-mRNA复合物）解析线粒体周翻译热点。
• 过氧化物酶（APEX2）的酪酰胺标记效率在蛋白质中高达99%，但RNA标记率仅0.01%。MERR-APEX-seq通过硫代核苷酸（s⁴U）将标记效率提升数百倍，揭示了内质网腔新型小RNA。

化学工具创新：

• 光氧化技术（如Halo-seq）利用二溴荧光素（DBF）产生单线态氧标记8-oxoG，结合点击化学富集区室化转录组。
• 铱光催化剂（μMAP-seq）通过卡宾自由基实现纳米级空间精度的RNA标记，但存在线粒体脱靶问题。

RNA-centric高阶互作网络

活细胞靶向：

• 适配体系统（如MS2-MCP）需过表达，背景噪音高。分裂APEX2通过RNA模板重组降低噪音，但操作复杂。
• CRISPR-Cas13工具（如CARPID）可靶向内源RNA（如XIST lncRNA），但受限于向导RNA脱靶性。

固定样本分析：

• 抗体介导的TSA-MS绘制了核斑（speckle）蛋白质组与基因组互作图谱。
• O-MAP技术通过寡核苷酸探针实现多组学分析，仅需10⁶个细胞即可解析核仁等结构的分子架构。

未来展望

RNA互作网络的动态性和区室特异性功能化（如组蛋白基因座体）仍是未解之谜。整合机器学习与高通量互作数据，或将揭示RNA介导的相分离（LLPS）调控全局细胞结构的深层机制。