无痕环化RNA治疗系统的开发与综合评价：SCAP/mSCAP系统在蛋白表达与稳定性中的突破

这篇研究开发了两种无痕环化系统SCAP和mSCAP，通过将Anabaena内含子来源的E1E2序列整合至IRES-CVB3区域，实现了circRNA的高效环化。与传统的Ana-PIE系统相比，SCAP系统显著提升蛋白表达量（1.8倍于Clean-PIE），同时保持circRNA稳定性（半衰期相似）和低免疫原性（IFN-β/TNF-α无显著差异）。研究通过EGFP/Gluc双报告基因验证，为circRNA疗法的理性设计提供了新范式。

　　

Development and comprehensive evaluation of scarless circularization systems for circular RNA therapeutics

Abstract
环状RNA（circRNA）因其闭环结构带来的稳定性和持续蛋白表达能力，成为RNA疗法的潜力候选。传统环化方法如Anabaena permuted intron-exon（Ana-PIE）系统会引入外源"瘢痕"序列，可能影响功能。本研究基于Ana-PIE开发了两种无痕环化系统——通过将E1E2序列整合至内部核糖体进入位点（IRES）的SCAP系统，以及突变E2序列的mSCAP系统。通过系统比较环化效率、蛋白产量、稳定性和免疫原性，发现SCAP系统能显著提升蛋白表达，同时维持circRNA的稳定性和低免疫原性特征。

Introduction
circRNA通过反向剪接形成共价闭环结构，其缺乏5'/3'末端的特性赋予其抗核酸外切酶降解的能力。Ana-PIE系统依赖外源E1E2序列引导环化，但残留的"瘢痕"可能干扰翻译或触发免疫反应。既往研究对无痕系统的优势存在争议：Qiu等报道Clean-PIE可降低免疫原性，而Lee等发现无痕设计对免疫应答无影响。本研究通过开发新型SCAP/mSCAP系统，首次在IRES区域实现功能性E1E2序列整合，为circRNA生产提供更优解决方案。

Results

Development of "scarless" circular RNA system
SCAP系统通过生物信息学分析锁定IRES-CVB3中的E1E2样序列（CTTAGAAGT），将其拆分为5'/3'片段作为环化引导元件。mSCAP则通过定点突变使E2样序列（AGAAGT→AAAATC）完全匹配Anabaena原型。两种系统环化效率均达80%，与Ana-PIE相当。HPLC和RNase R消化证实产物纯度>90%，Sanger测序验证环化位点精确性（SCAP形成TGAAGATTC接头，mSCAP为CTAAAATTC）。

Evaluation of protein production
在HEK293T细胞中，SCAP-circEGFP荧光强度较Ana-PIE提高1.5倍（p<0.01），circGluc的累积荧光素酶活性增加1.8倍（p<0.001）。RNAfold预测显示，Ana-PIE的MFE为-596.90 kcal/mol，其外源序列形成独立茎环结构；而SCAP保持IRES天然构象，mSCAP虽形成稳定茎环（MFE -547.10 kcal/mol），但破坏了IRES domain I的关键功能区，导致蛋白产量降低。

Evaluation of stability
72小时追踪显示，SCAP-circRNA半衰期（52.3小时）与Ana-PIE（49.8小时）相当，而mSCAP延长至58.1小时（p<0.05）。这种稳定性提升可能源于突变引入的刚性结构，但代价是翻译效率下降，凸显了RNA二级结构设计中"稳定性-翻译效率"的权衡关系。

Evaluation of immunogenicity
RNA-seq分析显示，SCAP与Ana-PIE转染组的转录组与未处理组高度相似（Spearman rho>0.97）。差异基因数≤13个，且先天免疫相关通路无显著富集（p>0.05）。ELISA检测证实IFN-β、TNF-α等细胞因子水平与阴性对照无统计学差异，而poly(I:C)阳性对照引发强烈反应（p<0.0001）。

Comparison with clean-PIE
与采用T4td内含子的Clean-PIE系统相比，SCAP-circEGFP在HEK293T中的蛋白产量高出80%（p=0.0001），但半衰期略短（1.16倍差异，p=0.036）。两种系统均未检测到显著免疫激活，表明环化策略差异主要影响翻译而非免疫识别。

Discussion
该研究突破性地将环化必需序列整合至翻译调控元件IRES内，解决了传统无痕系统需改造编码序列的局限。SCAP系统的高效性可能源于：①避免外源序列对核糖体扫描的干扰；②维持IRES天然构象以优化起始因子募集。值得注意的是，mSCAP的稳定性提升提示特定茎环结构可增强circRNA抗降解能力，这为设计长效RNA药物提供了新思路。未来研究需在动物模型中验证这些发现，并探索不同IRES类型对系统性能的影响。

Materials and methods
关键技术包括：① 10% PEG-8000优化环化反应条件；② HPLC联合RNase R消化实现>90%纯度；③ 双报告基因（EGFP/Gluc）定量评估系统性能；④ RNA-seq结合qPCR全面分析免疫应答。所有实验均设≥3次生物学重复，统计学分析采用GraphPad Prism 8完成。