优化人类初始多能干细胞培养体系：DNA甲基化增强与基因组稳定性提升的新策略

本研究针对现有MEK抑制剂依赖性人类初始多能干细胞(PSCs)培养体系导致的DNA低甲基化、印记丢失和基因组不稳定等问题，通过双荧光报告系统和高通量筛选技术，开发出LAY等四种新型培养基。这些培养基不仅能有效诱导和维持初始多能状态，更显著改善了全基因组DNA甲基化水平（接近植入前胚胎状态），部分恢复了印记位点甲基化，并大幅提升基因组稳定性。该成果为胚胎发育研究和再生医学应用提供了更优化的细胞模型。

　　

在干细胞研究领域，人类初始多能干细胞(naive PSCs)因其更接近植入前胚胎内细胞团(ICM)的特性，成为研究早期发育和疾病建模的理想工具。然而现有培养体系长期依赖MEK抑制剂，导致DNA甲基化异常、基因组印记丢失和染色体不稳定等突出问题。这些问题严重制约了naive PSCs在基础研究和临床转化中的应用价值。

针对这一瓶颈问题，同济大学的研究团队在《Protein & Cell》发表重要研究成果。研究人员首先建立了一个创新的双荧光报告系统（ALPG-promoter-RFP; OCT4-ΔPE-GFP），通过"初始-定型-初始"(npn)状态转换模型，对1685种化合物进行高通量筛选。最终开发出LAY、LADY、LUDY和LKPY四种新型培养基，其中LAY系统表现尤为突出。

关键技术方法包括：1）双荧光报告系统构建与高通量筛选；2）全基因组甲基化测序(WGBS)分析；3）转座元件表达谱检测；4）基因组稳定性评估（碱性彗星实验和γH2AX检测）；5）囊胚样结构(blastoid)形成实验验证多能性。

研究结果部分：

高内涵分析筛选鉴定初始多能性关键化合物
通过npn转换系统筛选出7种关键化合物，包括Abl1抑制剂Rebastinib、FGFR抑制剂Debio-1347等。这些化合物显著提高双荧光信号强度，其中AZD1480（JAK2抑制剂）在后续实验中表现出独特优势。

化学组合建立初始多能性培养系统
从127种组合中优选出4种有效培养基（LAY、LADY、LUDY、LKPY）。这些培养基不仅能长期维持naive状态（>20代），还能实现定型PSCs向naive状态的重置，并支持诱导多能干细胞(iPSCs)的生成。细胞保持正常核型，高表达SUSD2等naive标志物。

全基因组转录组特征分析
RNA-seq显示四种培养基诱导的细胞与已报道的naive PSCs聚类，但更接近体内ICM状态。GO分析显示LAY系统特异性富集囊胚发育相关通路，所有系统均显示DNA甲基化相关通路激活。

全基因组DNA甲基化状态
WGBS揭示关键发现：1）LAY系统维持约50%甲基化水平，显著高于t2iLG和5iLAF系统；2）能部分保留印记控制区(ICRs)甲基化（如PEG3、MIR512-1等位点）；3）上调DNA甲基转移酶DNMT3B表达。这些特征使甲基化谱更接近真实ICM。

转座元件甲基化状态
新型培养基显著提高LTR、SINE等转座元件(TEs)的甲基化水平，相应降低其转录活性。这一发现解释了基因组稳定性提升的潜在机制，因为TE激活是基因组不稳定的重要诱因。

X染色体状态分析
H9细胞系验证显示：1）LAY系统维持更高的X染色体整体甲基化；2）保持XIST表达模式与报道的HT细胞（双活性X染色体）相似；3）呈现naive状态典型的FGF4^high/FGF2^low表达特征。

基因组稳定性提升
相比5iLAF系统，LAY培养的细胞表现出：1）碱性彗星实验显示DNA断裂减少；2）γH2AX焦点数量降低；3）对电离辐射和依托泊苷的抵抗增强；4）基因组稳定性相关基因（如DDX5、XRCC4等）上调。这些发现证实减少MEK抑制可改善基因组完整性。

多能性验证
长期培养（>50代）的LAY细胞仍能：1）形成包含OCT4⁺内细胞团、CDX2⁺滋养层和GATA6⁺下胚层的囊胚样结构；2）在鼠嵌合胚胎中贡献ICM和滋养层谱系，证实其发育全能性。

研究结论与讨论：
该研究通过系统性筛选建立了不依赖MEK抑制的naive PSCs培养体系，解决了该领域长期存在的DNA低甲基化和基因组不稳定问题。特别是LAY系统仅需添加JAK2抑制剂AZD1480即可维持naive状态，其甲基化水平（约50%）最接近体内ICM，并能部分保留基因组印记。这种"表观遗传优化"的naive PSCs为胚胎发育研究、疾病建模和再生医学提供了更可靠的细胞工具。

值得注意的是，虽然新系统显著改善了甲基化水平，但完全恢复植入前胚胎的印记模式仍具挑战性。此外，不同培养条件对表观基因组的影响存在差异（如LUDY含FGF/ERK抑制剂组合表现较差），提示信号通路精确调控的重要性。未来研究可进一步优化培养成分，使体外naive状态更完美模拟体内状态。

这项由Yan Bi、Jindian Hu等完成的研究获得国家重点研发计划等项目支持，相关技术已申请四项专利。其创新性体现在：1）建立高效筛选平台；2）开发出表观遗传更稳定的培养系统；3）为理解naive状态调控提供了新见解，对推动干细胞基础研究和临床应用具有重要价值。