低成本制备大肠杆菌GABase用于γ-氨基丁酸(GABA)含量及谷氨酸脱羧酶(GAD)活性的高效分光光度检测

本研究针对商业GABase试剂成本高昂且酶纯度不足的问题，开发了基于大肠杆菌重组表达的His6-GABA-T（γ-氨基丁酸转氨酶）和His6-SSDH（琥珀酸半醛脱氢酶）制备方案。通过Ni2+-亲和层析纯化获得高活性酶制剂，验证显示其检测GAD活性和GABA含量的效果与商业试剂相当，为研究GABA代谢通路提供了经济可靠的新工具。

　　

γ-氨基丁酸(GABA)作为生物界广泛存在的非蛋白氨基酸，在神经传导、应激响应等生理过程中扮演着关键角色。从哺乳动物的神经抑制信号传递到植物抵御干旱胁迫的保卫细胞调控，这种简单分子展现出惊人的功能多样性。然而研究GABA代谢面临方法学挑战：传统放射性检测存在安全隐患，高效液相色谱(HPLC)设备门槛高，而市售GABase试剂不仅价格昂贵，其酶组分比例和纯度信息也不透明。这种现状严重制约了GABA相关研究的广泛开展。

加拿大女王大学的研究团队在《Biology Methods and Protocols》发表的研究中，创新性地开发了基于大肠杆菌表达系统的"自助式"GABase制备方案。通过克隆表达E.coli的gabT和gabD基因，获得C端带His₆标签的重组酶，经Ni²⁺-亲和层析纯化后，GABA-T和SSDH比活性分别达到17 U/mg和19 U/mg，显著优于商业产品。研究团队将质粒载体存入AddGene数据库，使该方法具备良好的可重复性和推广价值。

关键技术方法包括：从大肠杆菌基因组PCR扩增目标基因并克隆至pET30a载体；异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达；French Pressure细胞破碎和Ni²⁺-FPLC纯化；微孔板分光光度法检测340 nm处NADPH生成量。使用14日龄拟南芥幼苗的根和茎组织提取物进行方法验证。

【Cloning and expression of recombinant E.coli SSDH and GABA-T】
研究团队设计特异性引物从大肠杆菌基因组DNA中扩增出gabT和gabD基因，成功构建pET30a-His₆重组质粒。测序验证的质粒已存入AddGene数据库，为后续研究提供标准化工具。

【Purification of recombinant E.coli SSDH and GABA-T】
优化后的纯化流程获得电泳级纯度的酶制剂，其中GABA-T和SSDH的回收率分别为33%和13%。添加30 mM咪唑的洗脱条件有效去除了污染性谷氨酸脱氢酶(GDH)活性。

【Enzyme activity assays】
建立的GABA标准曲线(Y=0.01598X-0.009592)线性良好，检测限达100 nmol。对比实验显示自制GABase测定拟南芥GAD1活性的结果与商业试剂无显著差异(p<0.05)，但反应达到平台期的时间缩短3倍。

【GAD extraction and activity assays】
拟南芥根部GAD活性显著高于茎部，与组织特异性表达模式相符。该方法成功检测到pH 5.8时GAD的最适活性，验证了植物GAD的酸性激活特性。

【GABA extraction and determination】
通过硫代水杨酸提取结合GABase法，测得拟南芥根和茎的GABA含量与文献报道的HPLC数据一致，证实了方法的可靠性。

这项研究突破了GABA检测的技术瓶颈和经济壁垒，其创新价值体现在三个方面：首先，建立的标准操作流程使普通实验室都能以1/10的成本获得高纯度GABase；其次，明确组分的重组酶系统为GABA-T和SSDH的动力学研究奠定基础；最后，快速高效的检测方案特别适合大规模样本筛查。正如作者强调的，该方法不仅适用于植物GABA研究，还可拓展至微生物代谢工程和神经退行性疾病机制探索等领域。随着GABA在抗逆性调控和神经保护作用中的研究深入，这种经济可靠的检测工具必将推动相关领域的突破性进展。