基于NEM-SSA酶循环法的生物样本中谷胱甘肽(GSH/GSSG)精准检测新策略

针对生物样本中谷胱甘肽(GSH/GSSG)检测方法存在灵敏度低、流程复杂等问题，兰州大学团队开发了以N-乙基马来酰亚胺(NEM)为掩蔽剂、5-磺基水杨酸(SSA)为蛋白去除剂的酶循环检测法。该方法在细胞、小鼠血液及组织中验证显示，可精准测定BSO处理后的GSH/GSSG比值变化，为氧化应激相关疾病研究提供了标准化工具。

　　

谷胱甘肽作为细胞内最重要的抗氧化分子，其还原型(GSH)与氧化型(GSSG)的动态平衡是评估细胞氧化应激状态的金标准。然而现有检测技术面临三大困境：高效液相色谱(HPLC)耗时耗力、电化学检测易受干扰、传统酶法无法区分GSH/GSSG。更棘手的是，样本前处理过程中GSH易自发氧化，导致GSSG假阳性结果。这些瓶颈严重制约了从心血管疾病到神经退行性变等氧化应激相关疾病的研究进展。

兰州大学研究人员在《Analytica Chimica Acta》发表的研究中，创新性地将NEM的快速膜渗透特性与SSA的蛋白沉淀优势相结合，建立了一套完整的酶循环检测体系。关键技术包括：使用NEM在30秒内完成GSH烷基化阻断，采用SSA实现温和去蛋白化，通过谷胱甘肽还原酶(GR)介导的NADPH循环放大信号，最终借助DTNB显色反应实现412 nm波长下的超敏检测。

【细胞培养】
采用LO2、HeLa、A549三种细胞系验证方法的普适性，发现BSO处理后HeLa细胞总GSH下降40%，GSH/GSSG比值从>100骤降至15，证实方法可捕捉细微氧化状态变化。

【标准曲线建立】
构建0.3125-30 μM的GSH和0-10 μM的GSSG标准曲线，R²>0.999，最低检测限达纳摩尔级，较传统HPLC灵敏度提升10倍。

【方法学优势】
相较2-乙烯基吡啶(2-VP)需60分钟反应时间，NEM仅需30秒即可完成GSH掩蔽；SSA在pH 3.0条件下既能有效沉淀蛋白，又避免强酸导致的GSH人工氧化。小鼠肝脏检测显示，该方法GSSG含量较酸处理法低80%，真实反映体内水平。

这项研究的意义在于：首次系统评估了前处理环节对GSH/GSSG比值的影响机制，建立的标准化流程使不同实验室数据具有可比性。特别值得注意的是，在小鼠血浆中检测到50 μM的GSH浓度，为建立物种间氧化应激标志物参考区间奠定基础。该方法操作简便、成本仅为HPLC的1/5，有望成为氧化应激研究领域的金标准。