东方利什曼原虫中链脱氢酶/还原酶超家族成员醌氧化还原酶的生化与动力学特性研究

本研究针对利什曼病治疗靶点醌氧化还原酶(QOR)，首次解析了东方利什曼原虫PCM2株(LoQOR)的催化机制。研究人员通过稳态动力学和快速动力学技术，发现该非Zn2+依赖型中链脱氢酶/还原酶(MDR)超家族成员采用非常规的乒乓机制催化NADH向甲萘醌的电子传递，并利用AlphaFold 3.0预测模型鉴定了Thr131/Tyr134/Arg268等关键残基的功能。突变体分析表明Tyr134和Arg268决定催化模式切换，为MDR型QORs的药物设计提供了新见解。

　　

利什曼病作为一种由利什曼原虫引起的热带传染病，每年导致全球数百万人感染。尽管现有药物可治疗，但耐药性问题日益严重，亟需开发新型靶向药物。在泰国新发现的东方利什曼原虫PCM2株可引起致命的内脏利什曼病，其基因组分析揭示了一个潜在药物靶点——属于中链脱氢酶/还原酶(MDR)超家族的醌氧化还原酶(QOR)。这类酶通常通过NAD(P)H催化醌类化合物还原，在寄生虫抗氧化防御中起关键作用。然而，东方利什曼原虫QOR(LoQOR)的催化机制和结构特征尚未阐明，这限制了靶向药物开发。

泰国农业大学的研究团队通过生物信息学分析确认LoQOR属于非Zn²⁺依赖型MDR超家族。利用稳态动力学和停流光谱技术，首次发现该酶采用罕见的乒乓机制催化电子从NADH向甲萘醌转移。通过AlphaFold 3.0构建的预测模型识别出Thr131、Tyr134和Arg268等可能参与NADH结合的残基。随后的位点定向突变和动力学分析揭示，Tyr134和Arg268突变会导致催化机制从乒乓模式转变为三元复合物模式，表明这些残基决定反应路径选择。该成果发表于《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics》，为开发抗利什曼病药物提供了重要理论基础。

关键技术包括：1）从东方利什曼原虫PCM2株基因组中克隆qor基因并进行重组表达；2）采用稳态动力学和停流光谱分析酶活性和反应机制；3）利用AlphaFold 3.0进行三维结构预测和分子对接；4）通过位点定向突变构建Thr131Val、Tyr134Phe、Tyr134His、Arg268Lys和Arg268Gln突变体。

Plasmid, bacteria, culture media, and chemical agents
研究团队从东方利什曼原虫PCM2株基因组中克隆qor基因，构建pET28a重组质粒，在大肠杆菌BL21(DE3)中实现可溶性表达。

Bioinformatics and modeled structure analysis of LoQOR
生物信息学分析显示LoQOR与已知QORs具有高度同源性，属于MDR超家族非金属离子依赖亚类。AlphaFold预测模型显示其具有典型的MDR折叠结构，并识别出NADH结合口袋中的关键残基。

Conclusion
证实LoQOR采用非常规的乒乓机制催化反应，结构预测指导的突变研究阐明Tyr134和Arg268是决定催化模式的关键残基。这些发现拓展了对MDR超家族非金属酶催化多样性的认知。

Protein information
LoQOR的氨基酸序列已收录于NCBI数据库（登录号XP_067066158.1），为后续研究提供参考。

该研究首次系统表征了东方利什曼原虫QOR的生化特性，突破性地发现MDR超家族酶可采取不同催化机制。特别值得注意的是，通过计算机预测指导的实验验证，确立了Tyr134和Arg268作为"催化模式开关"的关键作用。这一发现不仅为理解MDR超家族的催化多样性提供了新视角，更重要的是为开发针对利什曼病QOR的特异性抑制剂指明了方向——通过干扰这些关键残基与底物的相互作用，可能实现对寄生虫特异性QOR的选择性抑制。此外，研究建立的实验体系和分析方法，为研究其他原生动物病原体的氧化还原酶提供了技术范式。