基于超高分辩MALDI FT-ICR质谱技术的工程化大肠杆菌脂连接寡糖异质性分析及其在糖缀合物疫苗开发中的应用

为解决多药耐药病原体疫苗开发中O-抗原多糖(PS)结构异质性分析的难题，研究人员采用超高分辩基质辅助激光解吸电离(MALDI)傅里叶变换离子回旋共振(FT-ICR)质谱技术，系统研究了工程化大肠杆菌(E. coli) O2型脂连接寡糖(LLOs)的结构特征。通过两种方法（完整LLOs分析和酸性水解片段分析）揭示了O-PSs重复单元(RU)的组成异质性，证实了与糖缀合物疫苗中O-抗原的结构一致性，为肠外致病性大肠杆菌(ExPEC)疫苗的理性设计提供了关键分析工具。

　　

随着全球多药耐药细菌感染的日益严峻，开发新型疫苗成为迫切的公共卫生需求。肠外致病性大肠杆菌(ExPEC)是尿路感染和败血症的主要病原体，其表面O-抗原多糖(O-PSs)是疫苗设计的理想靶点。传统疫苗开发面临两大挑战：一是190余种E. coli O-血清型存在复杂的结构异质性；二是现有技术难以全面表征作为疫苗前体的脂连接寡糖(LLOs)结构。这些LLOs作为连接载体蛋白与O-PSs的关键分子，其RU组成和修饰直接影响疫苗的免疫原性。目前质谱技术多限于短链LLOs分析，而电泳方法无法提供精细结构信息，制约了疫苗的理性设计。

针对这一科学难题，来自荷兰的研究团队在《Carbohydrate Polymers》发表研究，创新性地将超高分辩MALDI FT-ICR质谱技术应用于工程化E. coli O2型LLOs的系统分析。研究人员采用两种策略：一是对提取纯化的完整LLOs进行直接质谱分析；二是通过温和酸水解细菌生物质获得O-PS片段进行分析。通过负离子和正离子模式检测，结合MS/MS验证，全面解析了LLOs的结构特征。

关键技术包括：1) 使用15T solariX XR FT-ICR质谱仪进行宽范围(m/z 2021-35000)高分辨检测；2) 优化DHAP和α-cyano基质体系分别用于完整LLOs和片段分析；3) 碰撞诱导解离(CID)技术用于RU组成验证；4) 借鉴Urakami-Hinou法直接分析水解生物质样本。所有样本来源于Janssen Vaccines提供的基因工程E. coli W3110菌株，该菌株通过WaaL连接酶突变阻断完整LPS合成，专用于LLOs富集。

研究结果部分，3.1章节揭示了LLOs的完整结构特征。负离子模式下检测到4-17个RU的完整LLOs，正离子模式则主要观察到缺失焦磷酸脂质的B₁型片段(5-15RU)。计算得出分散度(?)为1.075±0.004（负模式）和1.035±0.001（正模式），与LC-FLD-MS结果一致。同位素分辨谱图还发现了两种异质性：一是约6%的LLOs缺失一个FucNAc残基；二是存在C₅₀与C₅₅脂质长度变异，这与Campylobacter jejuni中报道的脂质异质性相似。

3.2章节展示了水解生物质直接分析的创新方法。采用DHB/1,5-DAN/NaHCO₃基质体系，成功检测到1-4个RU的完整水解片段及RU内部断裂产物。虽然该方法实现了快速RU分析，但发现水解过程会人为增加"缺失FucNAc"假阳性信号（比例升至66%），提示该方法在定量异质性方面存在局限。

3.3章节通过MS/MS验证了结构一致性。对比LLOs衍生的2RU B型离子（m/z 1679.6729）与糖缀合物疫苗中相同片段的CID谱图，两者碎片模式高度一致，包括特征性交叉环断裂碎片（如m/z 619.2322）。这证实了工程菌生产的LLOs与最终疫苗中O-抗原的结构等同性，为生产工艺提供了质控依据。

该研究通过多维质谱分析策略，首次实现了对长链E. coli LLOs(达17RU)的高通量结构解析。其重要意义体现在三方面：方法学上，建立了超高分辩MALDI FT-ICR分析多糖异质性的新范式；应用价值上，为ExPEC等多价糖缀合物疫苗的抗原质控提供了关键工具；科学认知上，揭示了工程菌LLOs的天然异质性特征（如脂质长度变异和FucNAc缺失），这些发现将指导后续的菌株优化。特别值得注意的是，研究团队验证了"粗糙型LPS菌株"中LLOs的直接分析方法，这为疫苗生产过程的快速监测开辟了新途径。正如作者指出，该方法可扩展至其他O-血清型分析，但需针对不同理化性质的O-PSs（如O-乙酰化修饰的O25B型）进行参数优化。这项研究标志着质谱技术在复杂糖疫苗表征领域的重要突破，为应对多药耐药危机提供了新的技术支撑。