茶树‘英红9号’乙胺合成关键酶基因CsAlaDC转录因子的筛选

　　

摘要：

【目的】茶氨酸是由底物乙胺和谷氨酸经茶氨酸合成酶催化合成。乙胺是茶树茶氨酸生成的主要限制因子，其由丙氨酸脱羧酶（CsAlaDC）催化丙氨酸脱羧而来。通过酵母单杂交从茶叶文库中筛选获得调控CsAlaDC的转录因子，从转录因子角度探究茶树体内乙胺合成调控的分子机制，为茶氨酸合成和后续开展茶树遗传改良提供理论基础和技术参考。【方法】以‘英红9号’茶树为材料，通过PCR克隆CsAlaDC启动子，以其为诱饵，利用酵母单杂交从文库中筛选获得候选转录因子，克隆候选转录因子的CDS，并回转验证。利用生物信息学方法对候选转录因子进行蛋白结构域、蛋白大小及可溶性分析，借助双荧光素酶试验探究候选转录因子对CsAlaDC的表达调控作用，并用亚细胞定位技术测定候选转录因子在细胞内的分布情况。【结果】克隆获得‘英红9号’茶树CsAlaDC启动子，包含真核生物基本的TATA-box和CAAT-box等启动子核心元件，I-box、G-Box、TCT-motif、TCCC-motif、Box4等光响应相关元件，CAT-box分生组织表达相关顺式作用元件，以及ABRE脱落酸响应元件、TC-rich repeats防御和压力反应顺式作用元件，还有MYB、MYC和WRKY等转录因子家族识别结合位点。以CsAlaDC启动子为诱饵进行酵母单杂交，从‘英红9号’cDNA文库中筛选获得17个结合蛋白，经初筛，获得5个候选转录因子，克隆CDS，并回转验证，获得3个转录因子：CsFBX、CsBBX和CsASR。双荧光素酶试验表明，CsBBX和CsASR对CsAlaDC具有转录激活作用，CsFBX无显著调控活性。亚细胞定位表明，CsFBX和CsBBX定位于细胞核，CsASR定位于细胞核和细胞质。【结论】从‘英红9号’cDNA文库中筛选获得3个调控乙胺合成关键酶基因CsAlaDC的转录因子：CsFBX、CsBBX和CsASR，均能结合CsAlaDC启动子，且CsBBX和CsASR对CsAlaDC具有转录激活作用。