基于甲基化捕获测序技术鉴定日本阿尔茨海默病患者血液中的DNA甲基化诊断标志物

本研究针对阿尔茨海默病(AD)诊断标志物匮乏的现状，采用甲基化捕获测序(MC-seq)技术首次在12例淀粉样蛋白PET阳性AD患者和12例认知正常老年人的血液样本中鉴定出ANKH、MARS等5个差异甲基化区域(DMRs)，结合APOEε4基因型构建的诊断模型AUC达0.81，为AD早期诊断提供了新型表观遗传学标志物。

　　

在老龄化社会背景下，阿尔茨海默病(AD)已成为全球公共卫生危机。目前诊断主要依赖临床症状和脑脊液检测，但侵入性操作限制了临床应用。尽管血液DNA甲基化作为潜在标志物被广泛研究，但传统甲基化芯片仅覆盖人类基因组3%的CpG位点，且既往研究结果重复性差。这主要由于芯片技术存在分辨率低、覆盖范围有限等固有缺陷，导致大量疾病相关CpG位点尚未被发现。

日本国立长寿医疗研究中心的研究团队创新性地采用甲基化捕获测序(MC-seq)技术，通过对24例经淀粉样蛋白PET确诊的日本老年受试者(12例AD vs 12例认知正常)全基因组甲基化分析，结合两轮独立队列验证(n=96×2)，最终鉴定出ANKH、MARS、ANKFY1、LINC00908和KLF2基因的5个差异甲基化区域(DMRs)。研究发现这些DMRs多位于基因体区，平均甲基化差异约5%，其中ANKH和MARS联合APOEε4基因型的诊断模型曲线下面积(AUC)达0.81。该成果发表于《Clinical Epigenetics》，为AD无创诊断提供了新思路。

关键技术包括：(1)采用TruSeq甲基化捕获EPIC试剂盒对107Mb基因组区域进行靶向富集；(2)对发现队列(n=24)进行甲基化捕获测序(MC-seq)，覆盖330万CpG位点；(3)通过双硫酸盐扩增子测序(BA-seq)在两个独立验证队列(n=48×2)中确认DMRs；(4)使用负担检验(Burden test)评估DMRs显著性；(5)构建包含APOEε4的机器学习诊断模型。

研究结果：
背景：比较12例PiB-PET阳性AD患者与12例阴性对照的血液甲基化谱，发现106个候选DMRs，其中81%呈低甲基化。

方法验证：在首个验证队列中，88个DMRs通过BA-seq分析，发现ANKH内含子区甲基化降低4.74%(p=0.0034)，MARS外显子区降低5.17%(p=0.0054)。

独立验证：在第二验证队列中，5个DMRs保持相同变化趋势，meta分析显示ANKH(p=0.0017)和KLF2(p=0.0015)甲基化改变最显著。

诊断价值：结合APOEε4，ANKH+MARS组合的诊断效能(AUC=0.81)显著优于单独使用APOEε4(AUC=0.77)。

机制探讨：ANKH基因rs112403360多态性与AD风险相关，其内含子低甲基化可能通过影响基因表达参与葡萄糖代谢异常；CHRNE基因体甲基化改变可能干扰胆碱能神经传递。

该研究首次证实MC-seq技术在AD血液标志物发掘中的优势，突破传统芯片技术的局限性。发现的DMRs多位于基因体区而非传统关注的CpG岛岸，提示AD相关甲基化改变可能存在新的分布规律。虽然甲基化差异幅度较小(约5%)，但通过多CpG位点联合分析提高了检测灵敏度。研究局限性包括样本量较小、未评估DMRs在脑组织的表达相关性等。未来扩大样本量并开发特异性捕获探针，有望发现更多稳健标志物。这些发现不仅为AD早期诊断提供新工具，也为理解表观遗传在AD发病中的作用提供了新视角。