飞秒激光基质透镜支架增强干细胞源性视网膜色素上皮片层功能与成熟度的研究

本研究针对视网膜色素上皮(RPE)细胞替代治疗中细胞功能不成熟和移植存活率低的问题，创新性地采用飞秒激光基质透镜去细胞化支架(dfLEN)培养诱导多能干细胞(iPSC)分化的RPE细胞(iRPE)。研究发现dfLEN能显著提升iRPE细胞的抗氧化能力、上皮化特征和纤毛发生过程，移植实验显示该工程化细胞片层具有良好的生物相容性，为RPE相关疾病治疗提供了新型组织工程策略。

　　

视网膜色素上皮(RPE)作为眼部的"代谢清道夫"，在维持视觉功能中扮演着关键角色。这片位于视网膜后方的单层细胞不仅负责吞噬脱落的光感受器外节，还构成血-视网膜屏障，其功能障碍将直接导致年龄相关性黄斑变性(AMD)等致盲性疾病。尽管干细胞技术为RPE替代治疗带来希望，但移植细胞的功能不成熟、应激耐受性差等问题始终制约着临床转化。就像移植"未完成培训的新兵"难以胜任复杂战场，这些体外培养的iPSC-RPE(iRPE)细胞常因缺乏合适的微环境而功能受限。

为解决这一难题，湖南爱尔眼科医院研究所的研究团队独辟蹊径，将目光投向角膜屈光手术的"副产品"——飞秒激光基质透镜(fLEN)。这些透镜富含与Bruch膜相似的细胞外基质成分，经去细胞化处理(dfLEN)后成为理想的生物支架。发表于《Stem Cell Research》的这项研究揭示，dfLEN不仅能模拟天然RPE的生长环境，更能促进细胞功能成熟，为视网膜退行性疾病的治疗开辟新途径。

研究采用多学科交叉的技术路线：通过定向分化技术将iPSC诱导为iRPE；建立NaCl/DNase-RNase联合去细胞化方案制备dfLEN支架；运用RNA测序(RNA-seq)分析转录组差异；采用JC-1探针检测线粒体膜电位(MMP)；借助扫描/透射电镜(SEM/TEM)观察超微结构；最后在新西兰白兔模型中进行为期14天的移植评估。

构建dfLEN支架的iRPE片层
研究团队成功建立从hiPSC到iRPE的分化体系，获得的细胞呈现典型多边形形态并表达ZO-1、MITF等标志物。去细胞化处理后的dfLEN完全清除角膜细胞核成分，形成透明支架。培养60天的iRPE-dfLEN片层展现出与天然RPE相似的分层结构，黑色素颗粒顶部分布，RPE65和酪氨酸酶(TYR)正确定位。

dfLEN增强RPE特征与功能
相比传统培养板(TCP)，dfLEN培养的iRPE表达水平显著提升：最佳rophin(BEST)基因表达增加3倍，吞噬光感受器外节(POS)的能力提高40%。ELISA检测显示，色素上皮衍生因子(PEDF)分泌增加而血管内皮生长因子(VEGF)分泌减少，VEGF/PEDF比值降低60%，这对抑制病理性 angiogenesis至关重要。YAP蛋白核质转位实验证实dfLEN通过力学信号调控细胞行为。

提升氧化应激抵抗能力
在2500μM H₂O₂刺激下，dfLEN组细胞存活率比TCP组高35%。JC-1染色显示dfLEN能维持线粒体膜电位，减少活性氧(ROS)积累达56%。这种保护作用可能源于转录组中抗氧化相关基因的上调，使工程化细胞更能耐受移植后的氧化微环境。

促进上皮化与纤毛发生
RNA-seq分析发现dfLEN显著上调纤毛组装相关基因(FOXJ1、TEKT2等)，免疫荧光显示纤毛长度增加2.1倍。SEM观察可见dfLEN组细胞表面微绒毛排列有序，TEM证实其超微结构更接近天然RPE。这些变化使细胞获得更成熟的极化表型，有利于形成光感受器-RPE功能单元。

兔眼移植验证
将20-30μm厚的iRPE-dfLEN片层移植至新西兰白兔视网膜下腔，14天后光学相干断层扫描(OCT)显示移植物正确定位。视网膜电图(ERG)检测显示移植眼与对照眼的a波、b波振幅无显著差异，组织学分析未发现明显炎症反应，CD45染色阴性证实了良好的生物相容性。

这项研究开创性地将眼科临床废弃物转化为高价值生物材料，证明dfLEN支架能模拟天然Bruch膜的微环境，通过力学-生物学耦合作用促进iRPE功能成熟。特别是促进纤毛发生这一发现，为理解RPE细胞成熟机制提供了新视角。该策略不仅适用于细胞治疗，还可用于疾病建模和药物筛选平台构建。未来通过优化移植手术方式（如玻璃体切除术植入）和开发dfLEN基质水凝胶，有望推动工程化RPE片层的临床转化，为数以百万计的AMD患者带来光明希望。