基于核衣壳蛋白的间接ELISA法检测猪急性腹泻综合征冠状病毒抗体的建立及韩国猪群血清流行病学调查

本研究针对猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)在韩国缺乏系统血清流行病学调查的问题，开发了基于核衣壳蛋白(N蛋白)的间接酶联免疫吸附试验(N-iELISA)。研究人员通过原核表达系统制备重组N蛋白，优化检测条件，建立了一种特异性强、重复性好的血清学检测方法。应用该方法对韩国9个省份540份猪血清样本进行检测，发现SADS-CoV总体血清阳性率为8.70%，为韩国猪群SADS-CoV感染监测提供了可靠工具。该研究填补了SADS-CoV在韩国流行状况的研究空白，对防控该新发传染病具有重要意义。

　　

近年来，猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)作为一种新发猪肠道冠状病毒，在中国广东等地暴发流行，引起仔猪严重水样腹泻、呕吐和高死亡率，给养猪业造成重大经济损失。这种被认为起源于马蹄蝠的冠状病毒，虽然目前尚未发现感染人类的证据，但其广泛的细胞嗜性和跨种传播潜力引起了科学界的高度关注。更令人担忧的是，SADS-CoV的临床症状与其他猪肠道冠状病毒如猪流行性腹泻病毒(PEDV)和传染性胃肠炎病毒(TGEV)极为相似，使得临床鉴别诊断面临巨大挑战。尽管中国已对SADS-CoV开展了较为全面的分子和血清流行病学研究，但在韩国等邻近国家，该病毒的流行状况仍是一片空白。

针对这一研究缺口，来自忠南国立大学兽医学院的研究团队在《Virology Journal》发表了重要研究成果。他们基于SADS-CoV核衣壳蛋白(N蛋白)开发了一种高特异性间接ELISA检测方法(N-iELISA)，并首次系统调查了韩国猪群中SADS-CoV的血清流行状况。N蛋白作为冠状病毒中最保守且高度免疫原性的结构蛋白，是诊断标志物的理想选择。研究人员通过原核表达系统制备重组N蛋白，Western blot验证其免疫反应性，并通过棋盘滴定法优化检测条件，建立了标准化的N-iELISA方法。应用该方法对来自韩国9个省份的540份猪血清样本进行检测，获得了韩国首份SADS-CoV血清流行病学数据。

关键技术方法包括：1)原核表达系统制备重组SADS-CoV N蛋白；2)Western blot筛选阳性和阴性对照血清；3)棋盘滴定法优化N-iELISA反应条件；4)评价方法的特异性、重复性和临床性能；5)对韩国全国范围540份猪血清样本进行检测分析。样本来源于韩国动物植物检疫局2017-2023年间收集的猪群监测样本。

表达和纯化重组SADS-CoV N蛋白

研究人员将SADS-CoV N基因克隆至pET-28a(+)载体，在大肠杆菌BL21中表达。SDS-PAGE和Western blot分析证实，重组蛋白以可溶形式表达，分子量约48-63 kDa，能被抗His标签抗体特异性识别。这一步骤为后续ELISA建立了高质量的抗原基础。

通过Western blot筛选SADS-CoV阳性和阴性样本

使用重组N蛋白对猪血浆样本进行Western blot分析，筛选出7份阳性样本作为N-iELISA建立的阳性对照，同时确认7份2017年收集的阴性样本。这些标准样本为方法验证提供了重要参照。

建立N-iELISA

通过系统优化，确定最佳反应条件为：包被抗原浓度100 ng/well，血清稀释度1:200，二抗稀释度1:100,000，使用5%脱脂奶作为封闭液。建立的N-iELISA具有高重复性，批内和批间变异系数分别低于7.43%和13.63%。特别值得注意的是，该方法与PEDV阳性血清无交叉反应，显示出良好的特异性。

N-iELISA的临床性能评估

应用建立的N-iELISA检测韩国全国540份猪血清样本，结果显示SADS-CoV总体血清阳性率为8.70%(47/540)。地域分析发现，全罗北道和全罗南道阳性率最高(15.00%)，而江原道最低(1.67%)。这一结果首次证实SADS-CoV抗体在韩国猪群中的存在，提示该病毒可能在韩国某些猪群中传播。

这项研究具有多重重要意义：首先，建立的N-iELISA为SADS-CoV血清学监测提供了可靠工具；其次，首次揭示了SADS-CoV在韩国猪群中的流行状况，阳性率虽低于中国但不容忽视；再者，发现邻近中国的地区如全罗道和济州岛阳性率较高，提示需要加强边境地区监测。特别值得注意的是，尽管检测到抗体阳性，但研究团队前期粪便样本检测未发现病毒，这一现象值得深入探究。

研究也存在一定局限性：由于缺乏商业化ELISA试剂盒和中和试验验证，方法学验证不够全面；His标签可能对蛋白抗原性产生影响；样本采集时动物均无临床症状，难以确定感染时间。未来研究需要结合分子检测方法，开展更全面的流行病学调查，并探索SADS-CoV在韩国猪群中的传播动态和致病特征。这项研究为东亚地区SADS-CoV防控提供了重要科学依据，对防范新发动物传染病跨境传播具有警示意义。