纳米圆盘单分子下拉技术揭示脂质-蛋白质互作机制：AKT与PI(3,4,5)P3稳定结合的结构基础

为解决传统小单层脂质体(SUV)膜模型在稳定性、曲率均一性及单分子分辨率上的局限，美国伊利诺伊大学团队开发了基于纳米圆盘(Nanodisc)的脂质单分子下拉技术(lipid-SiMPull)，系统研究了磷脂酰肌醇磷酸(PIP)与信号蛋白的相互作用。研究发现纳米圆盘可实现真正的单分子检测，揭示AKT激酶域通过分子内相互作用稳定其PH结构域与PI(3,4,5)P3的结合，为膜相关信号传导机制研究提供了新范式。

　　

细胞膜上的磷脂不仅是结构组分，更是重要的信号分子。其中磷脂酰肌醇磷酸(PIP)通过与特定蛋白相互作用调控众多细胞过程，但其分子机制研究长期受限于技术瓶颈。传统的小单层脂质体(SUV)模型存在膜曲率异常、尺寸不均等问题，且无法实现真正的单分子观测。更棘手的是，像AKT这样的关键激酶如何通过PH结构域与PI(3,4,5)P₃稳定结合，其结构基础仍不明确。

为解决这些问题，美国伊利诺伊大学的研究团队在《Journal of Lipid Research》发表研究，创新性地将纳米圆盘技术引入单分子下拉系统。这种直径约10 nm的盘状磷脂双层结构，完美模拟了细胞膜的平坦特性，且能精确控制脂质组成。通过改造后的纳米圆盘单分子下拉技术，研究人员不仅实现了PI(3,4,5)P₃与AKT相互作用的单分子观测，更意外发现激酶域对PH结构域结合稳定性的调控作用。

研究采用四大关键技术：1）定制化纳米圆盘制备，通过生物素化膜支架蛋白MSP1D1包裹特定PIP；2）HEK293细胞瞬时转染获得EGFP标记的靶蛋白；3）全内反射荧光显微镜(TIRF)实现单分子成像；4）最大似然估计法(MLE)定量解离速率。这些方法使研究达到10-20 μM的检测灵敏度，并首次在天然膜环境下解析单分子结合事件。

在验证实验中，研究证实纳米圆盘能特异性捕获已知PIP结合蛋白：AKT-PH结合PI(3,4,5)P₃、PLCδ-2xPH结合PI(4,5)P₂等，且每个纳米圆盘仅结合单个蛋白分子。通过光漂白步数分析，发现SnxA以二聚体形式结合PI(3,5)P₂，而其他蛋白多为单体结合。

特别重要的是，相比SUV系统，纳米圆盘测得AKT-PH与PI(3,4,5)P₃的解离速率(k_off)更高（0.55 s^-1 vs 0.32 s^-1），揭示SUV可能因PIP簇聚效应高估结合稳定性。全长的AKT表现出更稳定的结合，暗示其他结构域的调控作用。

通过系列截短体实验，研究排除了C端疏水模体(HM)和Turn模体(TM)的贡献。关键发现是：激酶域中W80和Q218的突变显著增加再结合事件和解离速率。这表明激酶域通过分子内相互作用稳定PH-PIP₃结合，而Q218可能通过变构效应间接参与调控。

这项研究的意义在于：1）建立首个具有单分子分辨率的膜脂质-蛋白互作研究平台；2）揭示AKT膜定位的新调控机制；3）为开发靶向PIP-蛋白互作的药物提供新思路。纳米圆盘技术的引入，使得在天然膜环境下研究信号复合体组装成为可能，为膜生物学研究开辟了新途径。

论文最后指出，该技术可进一步应用于跨膜受体等膜蛋白研究，未来结合冷冻电镜等技术，有望揭示更复杂的膜信号传导机制。这项由Adriana Reyes-Ordo?ez等完成的研究，不仅解决了方法学难题，更为理解AKT等关键信号分子的膜调控提供了全新视角。