混合设计与面心中心复合设计联用优化rAAV生产中不同基因的全/空衣壳比例

本研究通过结合混合设计(MD)与面心中心复合设计(FCCD)，系统优化了重组腺相关病毒(rAAV)上游生产中的全衣壳比例(% full)和体积生产率(Log(Vp))。针对egfp、msh2和bdnf三种不同基因，研究人员发现GOI(基因目的片段)特性显著影响包装效率，其中rAAV基因组二级结构可能是关键因素。通过多响应优化策略，实现了egfp-rAAV的100倍Vp提升和bdnf-rAAV全衣壳12倍增加，为基因治疗载体生产提供了兼顾产量与质量的标准化方法。

　　

基因治疗领域面临的关键挑战是如何高效生产高质量的重组腺相关病毒(rAAV)载体。尽管rAAV因其低免疫原性和长期表达特性成为基因递送的金标准，但生产过程中普遍存在空衣壳占比过高的问题，这不仅降低治疗效率，还可能引发免疫反应。传统优化方法通常聚焦单一参数，难以解决质粒比例、转染条件与基因目的片段(GOI)特性间的复杂互作。更棘手的是，不同GOI可能通过影响细胞代谢或基因组二级结构，显著改变病毒包装效率，这使得通用化生产方案难以奏效。

丹麦技术大学的研究团队在《Gene Therapy》发表的研究中，创新性地将混合设计(MD)与面心中心复合设计(FCCD)相结合，建立了可适应不同GOI特性的rAAV生产优化平台。研究选取egfp、msh2和bdnf三种功能迥异的基因，系统分析了质粒比例、DNA总量与转染试剂(FectoVIR^?-AAV)的协同作用。通过量化体积生产率(Vp)、全衣壳比例(% full)和细胞活力三个关键指标，发现最优生产条件高度依赖GOI特性——例如bdnf需要截然不同的质粒比例来分别优化Vp和% full。令人振奋的是，该方法使egfp-rAAV的Vp提升近100倍，同时将bdnf-rAAV的全衣壳产量提高12倍。

研究主要采用三重瞬时转染技术，结合qPCR和ELISA定量病毒滴度与衣壳完整性。通过DNA二级结构预测工具分析不同GOI的基因组特征，发现线性化程度与包装效率正相关。实验设计采用JMP 16 Pro软件进行D-optimal混合设计和响应面分析，并通过去卷积算法解析多参数互作效应。

rAAV优化过程随GOI变化呈现多样性
研究发现不同GOI需要独特的优化策略：egfp在pHelper:pRepCap:pGOI为0.4:0.25:0.35时达到平衡；msh2偏好高pRepCap比例(0.2:0.6:0.2)；而bdnf则需根据目标选择不同方案——优化Vp时采用0.5:0.4:0.1，提升% full则需0.2:0.2:0.6。这种差异突显了GOI特异性优化的重要性。

病毒颗粒生产的优化揭示GOI依赖性差异
虽然Log(Vp)在三种GOI间差异较小(9.2-10.46)，但% full波动显著(0.18%-49%)。FCCD进一步放大了这种差异，使msh2的% full提升23倍。DNA二级结构分析显示，egfp基因组最线性化，其% full最高，暗示结构复杂性可能阻碍ITR(反向末端重复序列)识别。

模型验证与工艺改进
验证实验证实模型预测准确性，仅bdnf的% full出现偏差。与未优化条件(1:1:1质粒比例)相比，优化后egfp-rAAV的Vp提升100倍，msh2-rAAV全衣壳增加10倍，证明上游优化可大幅减少下游纯化压力。

该研究开创性地证明：GOI的生物学功能与基因组结构共同决定rAAV包装效率。MSH2可能通过干扰DNA修复机制降低产量，而BDNF则可能改变细胞能量代谢。更重要的是，研究表明通过合理设计上游条件，可同步优化产量与质量——这对降低基因治疗成本至关重要。混合设计与响应面方法的结合，为生物制药领域复杂工艺开发提供了范式转移，其方法论可扩展至其他病毒载体系统的优化。未来研究可探索更多GOI类型，并验证该策略在生物反应器规模的有效性。