S-亚硝基谷氨酸激活裂殖酵母Sty1和Pap1应激通路的分子机制及其在氧化还原稳态调控中的作用

本研究针对裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)在S-亚硝基谷氨酸(GSNO)应激下的响应机制展开深入探索。研究人员通过荧光成像、酶活性测定和基因表达分析等技术，首次揭示了MAP激酶Sty1和bZIP转录因子Pap1/Atf1在GSNO应激中的协同调控作用，阐明了GSNO通过诱导Sty1核转位激活pgr1和ctt1基因表达的分子通路，为理解真核生物应对硝化应激的分子机制提供了新见解。

　　

在生命活动中，活性氮物种(RNS)扮演着双面角色：既是重要的信号分子，又可能造成细胞损伤。其中S-亚硝基谷氨酸(GSNO)作为一氧化氮(NO)的主要储存形式，其代谢失衡会导致硝化应激。裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)作为研究真核生物应激响应的模式生物，其应对氧化应激的机制已有较多研究，但对GSNO诱导的硝化应激响应机制仍不清楚。特别是MAP激酶Sty1和bZIP转录因子Pap1/Atf1在此过程中的作用尚未阐明。

为回答这些问题，来自国内某研究机构的研究人员开展了一系列实验。研究首次系统揭示了GSNO通过激活Sty1-Pap1/Atf1信号轴调控裂殖酵母氧化还原稳态的分子机制，相关成果发表在《The Microbe》杂志。研究采用的主要技术包括：GFP标记蛋白的荧光显微成像观察核转位、谷胱甘肽含量测定、GR和过氧化氢酶活性分析、2,3-二氨基萘(DAN)法检测蛋白S-亚硝基化水平，以及实时定量PCR分析基因表达变化。

3.1 S. pombe在GSNO诱导的硝化应激下生长敏感性降低
通过生长曲线分析发现，野生型和Δsty1突变株对1-3 mM GSNO都表现出较低的敏感性，且Δsty1突变株在基础条件下生长较慢，表明Sty1参与基础生长调控但非GSNO敏感性的决定因素。

3.2 MAP激酶Sty1在GSNO处理后核内积累
使用GFP标记的Sty1菌株(EHH5)观察到，3 mM GSNO处理5分钟即可诱导Sty1显著核转位，15分钟达到峰值，30分钟返回胞质，呈现典型的应激响应动力学特征。

3.3 bZIP转录因子Atf1和Pap1的核内积累
研究发现基础状态下Atf1即定位于核内，GSNO处理后其核内积累进一步增强；而Pap1在3 mM GSNO处理后才发生核转位，表明二者响应机制存在差异。值得注意的是，Δsty1突变株中这些转录因子的核转位受损，暗示Sty1的上游调控作用。

3.4 胞质还原型和氧化型谷胱甘肽水平变化
谷胱甘肽测定显示Δsty1突变株基础GSH水平比野生型高约1.5倍，但GSSG含量更高，GSH/GSSG比值降低，反映其处于基础氧化应激状态。GSNO处理后野生型GSH增加但GSSG上升更显著，而Δsty1突变株GSH/GSSG比值反而提高。

3.5 细胞氧化还原酶活性改变
谷胱甘肽还原酶(GR)和过氧化氢酶活性测定发现，野生型中GR活性随GSNO浓度增加而降低，可能与酶蛋白S-亚硝基化有关；Δsty1突变株基础GR活性较高但GSNO处理后变化不显著。过氧化氢酶活性在Δsty1中基础水平较低且对GSNO更敏感。

3.6 GSNO处理未引起显著ROS/RNS生成
使用DCFDA和DHR123荧光探针检测发现，GSNO处理未引起活性氧(ROS)和活性氮(RNS)显著增加，证实其效应直接源于GSNO而非次级氧化产物。

3.7 细胞p-SNO池和GSNO还原酶活性变化
DAN法检测显示野生型存在基础p-SNO水平，1 mM GSNO处理后增加32%；而Δsty1突变株p-SNO变化不显著。GSNO还原酶活性在Δsty1中1 mM GSNO处理后升高30%，提示补偿机制激活。

3.8 pgr1、ctt1和atf1 mRNA转录水平变化
实时PCR分析发现，野生型中3 mM GSNO上调pgr1和atf1，1 mM上调ctt1；而Δsty1中ctt1表达下调，表明Sty1通过调控Atf1/Pap1影响这些基因表达。

研究结论与讨论：
该研究首次系统阐明了GSNO通过激活裂殖酵母Sty1-MAPK通路和bZIP转录因子Pap1/Atf1来维持氧化还原稳态的分子机制。主要创新发现包括：(1)证实GSNO可直接诱导Sty1和Pap1核转位而不依赖ROS/RNS生成；(2)揭示Δsty1突变株存在基础氧化应激状态；(3)发现GSNO通过转录和翻译后双重调控影响GR和过氧化氢酶活性；(4)阐明Sty1通过调控Atf1/Pap1影响pgr1和ctt1基因表达。这些发现为理解真核生物应对硝化应激的分子网络提供了新视角，对研究相关人类疾病如神经退行性病变和心血管疾病的发病机制具有重要参考价值。特别是GSNO还原酶活性的调控机制可能成为相关疾病治疗的潜在靶点。