基于DLLME-串联手性LC-MS技术的人肝微粒体中乙酰甲胺磷与甲胺磷立体选择性水解代谢研究及体外-体内外推

针对手性有机磷农药乙酰甲胺磷(ACP)和甲胺磷(MTD)立体选择性代谢机制不明的难题，研究人员开发了分散液液微萃取(DLLME)结合串联手性柱LC-MS的创新分析方法，首次揭示人肝微粒体中(S)-(-)-MTD水解速率是(R)-(+)-异构体的2.2倍，确定羧酸酯酶1(CES1)为关键代谢酶，为精准评估手性农药神经毒性风险提供了方法学突破。

　　

在全球化农业背景下，有机磷农药乙酰甲胺磷(ACP)及其代谢产物甲胺磷(MTD)作为高效杀虫剂被广泛使用，却因其手性结构可能产生差异化的神经毒性效应。尽管已有研究表明这两种化合物在环境中的降解具有立体选择性，但受限于手性分离技术的瓶颈，人类肝脏对其代谢的立体选择性特征始终未能阐明。这一认知空白直接影响了农药风险评估的准确性——毕竟当(S)-和(R)-对映体可能以不同速率被代谢时，传统将农药视为单一化合物的风险评估模型显然存在重大缺陷。

来自圣保罗大学的研究团队在《Microchemical Journal》发表的研究，通过开发分散液液微萃取(DLLME)与串联手性液相色谱-质谱(LC-MS)联用的创新技术平台，首次实现了人肝微粒体(HLM)中ACP和MTD对映体的同步分离与定量。研究发现ACP在人体肝脏中几乎不发生转化，而其代谢产物MTD则表现出显著的立体选择性代谢特征：(S)-(-)-MTD的清除速率达到5 mL·min^-1·kg^-1，较(R)-(+)-MTD快2.2倍。通过酶抑制实验和重组酶验证，研究锁定羧酸酯酶1(CES1)是介导这一选择性代谢的关键酶类。

关键技术方法包括：1) 采用Chiralpak IG-3与AS-H色谱柱串联的极性有机模式(POM)色谱系统；2) 化学计量学优化的DLLME前处理技术；3) 基于人肝微粒体的体外代谢模型；4) 体外-体内清除率预测(IVIVE)模型。

【优化手性LC-MS条件】
通过测试80种色谱柱-流动相组合，最终确立乙腈-乙酸体系的极性有机模式，在串联手性柱上实现基线分离（分离度R_s>1.5）。质谱采用正离子模式，优化后信号强度提升3-5倍。

【DLLME方法开发】
以四氯乙烷为萃取剂、乙腈为分散剂，在pH 6.0条件下获得>85%回收率，基质效应<15%，显著优于传统蛋白沉淀法。

【立体选择性代谢表征】
在200例HLM样本中发现：(S)-MTD的固有清除率(CL_int)为8.3 μL·min^-1·mg^-1，显著高于(R)-MTD。体外-体内外推预测人体肝清除值与文献报道的尿液排泄数据吻合。

【关键代谢酶鉴定】
苯甲酰基奎宁抑制实验显示CES1贡献率达76%，重组酶实验证实CES1对(S)-MTD的催化效率(k_cat/K_m)是(R)-MTD的1.8倍。

这项研究不仅建立了首个同时分析ACP/MTD对映体的DLLME-LC-MS方法，更重要的是揭示了人类肝脏对MTD的立体选择性代谢规律。这一发现对修订农药风险评估模型具有深远意义——当(S)-对映体被更快清除时，其在生物体内的实际暴露时间可能被低估。研究提出的"手性-手性"串联色谱策略，为其他手性农药的代谢研究提供了普适性技术框架。Leandro Oka-Duarte等学者特别指出，未来需要进一步探究其他水解酶（如对氧磷酶）的贡献，以及这种代谢选择性是否会导致不同人群的神经毒性易感性差异。