基于多重PCR-MALDI-TOF MS技术的七种人类转基因多重检测方法在基因兴奋剂分析中的应用研究

本研究针对体育竞技中基因兴奋剂检测的迫切需求，开发了一种结合多重PCR扩增与基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)分析的多重检测技术。研究人员设计了一套包含20个检测位点的检测系统，可同时检测EPO、FST、GH1、IGF1、MSTN、VEGFA和VEGFD等7种可能用于基因兴奋剂的转基因，在人类全血样本中达到1,500 cp/mL的检测限。该研究为反兴奋剂检测提供了高效、可靠的多重筛查工具，对维护体育竞赛公平性具有重要意义。

　　

在竞技体育领域，基因兴奋剂(gene doping)已成为反兴奋剂工作的新挑战。自2003年世界反兴奋剂机构(WADA)将基因兴奋剂列入禁用清单以来，如何有效检测这种通过基因治疗技术非法增强运动表现的行为一直是研究热点。传统检测方法如单重实时定量PCR(qPCR)通量有限，而全基因组测序(WGS)又存在成本高、耗时长等问题。德国科隆体育大学等机构的研究人员开发了一种创新性的多重检测方案，相关成果发表在《Scientific Reports》上。

研究人员采用多重PCR结合MALDI-TOF MS的技术路线，通过单碱基延伸(SBE)反应检测外显子-外显子连接(EEJ)特征。关键技术包括：1)设计20个检测位点的多重PCR引物组；2)优化两步PCR扩增程序提高灵敏度；3)开发特异性参考物质(RM)作为质控；4)使用人全血样本(n=111)和基因治疗马血浆样本验证方法。

基因兴奋剂检测板设计
研究团队针对7个可能用于兴奋剂的人类转基因(EPO、FST、GH1、IGF1、MSTN、VEGFA和VEGFD)设计了20个检测位点，每个转基因至少包含2个检测位点。通过特异性测试证实所有检测位点仅在与相应转基因存在时才产生信号。

灵敏度测试
在含500 ng基因组DNA背景下，优化后的两步PCR方案使大多数检测位点达到20-40拷贝/反应的检测限(LOD₉₅)。VEGFA_2位点灵敏度较低(80拷贝/反应)，但其他VEGFA检测位点可提供补偿。

参考物质设计
为区分野生型序列与质控信号，研究人员设计了含单点突变的线性参考物质(RM)。该RM在10拷贝/反应水平仍可稳定检出，为实验流程提供了可靠质控。

实际样本验证
在1 mL人全血中加标测试显示，所有转基因在1,500 cp/mL浓度下均被检出。对接受rAAV-hEPO基因治疗的马匹血浆分析表明，转基因EPO可在给药后14天内被检出，结果与qPCR一致。111例运动员样本检测均为阴性，证实方法特异性。

这项研究首次建立了可同时检测7种转基因的多重PCR-MALDI-TOF MS方法，其1,500 cp/mL的检测灵敏度虽略低于WADA认证的单重qPCR方法(10拷贝/反应)，但显著提高了检测通量和成本效益。特别值得注意的是，该方法采用外显子连接特征检测策略，可有效区分内源基因与转基因，且每个靶标设置多个检测位点，降低了因序列突变导致的假阴性风险。研究开发的突变型参考物质也为实验室质量控制提供了新思路。这些创新使该方法有望成为现有基因兴奋剂检测体系的重要补充，为维护体育竞赛的公平性提供新的技术支撑。