基于毛细管区带电泳-质谱联用技术的单克隆抗体电荷变体生物相似性与高级结构表征研究

本研究针对单克隆抗体(mAbs)电荷变体结构复杂性和生物相似性评估难题，创新性整合毛细管区带电泳(CZE-UV)与质谱(MS/MS)技术，成功解析了英夫利昔单抗(IFX)生物类似药电荷变体差异，并首次通过CE-MS/MS鉴定出琥珀酰亚胺中间体等关键翻译后修饰(PTM)，为抗体药物质量控制提供了高分辨分析新范式。

　　

在生物医药领域，单克隆抗体(mAbs)因其精准的靶向治疗能力已成为肿瘤、自身免疫疾病等重大疾病的核心治疗手段。然而，这类大分子药物的复杂性远超传统小分子药物——免疫球蛋白G(IgG)骨架上的氨基酸可能发生多种翻译后修饰(PTM)，包括天冬酰胺(Asn)脱酰胺、C端赖氨酸(Lys)剪切等，这些微观结构变化会形成电荷变体，直接影响抗体的稳定性、效价甚至临床安全性。更棘手的是，随着原研药专利到期，生物类似药必须通过严格的"指纹级"相似性验证，但现有技术难以精准捕捉电荷变体的结构差异。

法国斯特拉斯堡大学的研究团队在《Talanta》发表的研究中，开创性地将毛细管区带电泳(CZE)的分离优势与质谱(MS)的结构解析能力相结合。研究人员首先采用动态中性涂层CZE-UV技术，以英夫利昔单抗(IFX)原研药及其两种生物类似药(Flixabi^?和Remsima^?)为模型，发现CZE-UV能灵敏区分三种产品间微弱的电荷变体差异。随后通过酶切处理锁定差异来源，并在帕博利珠单抗(PBZ)分析中突破性地开发出CZE-UV馏分收集-富集-CE-MS/MS联用策略，实现了从完整抗体到肽段水平的全维度结构解析。

关键技术方法
研究采用动态涂层CZE-UV分离EMA/FDA批准的IFX和PBZ商业制剂；建立CZE馏分收集系统富集电荷变体；通过CE与高分辨串联质谱(MS/MS)联用进行PTM定位；运用胰蛋白酶/羧肽酶B等酶解策略验证修饰位点；通过表观迁移率变化关联特定PTM。

Infliximab Biosimilarity Assessment Using CZE-UV Analysis
CZE-UV成功分离IFX原研药的3个电荷变体（迁移时间19.8/21.1/22.4分钟），而两种生物类似药分别显示出不同的峰型分布。经羧肽酶B处理证实C端Lys剪切是导致IFX变体差异的关键因素，但生物类似药间额外差异提示存在其他PTM。

Structural Characterization of Pembrolizumab Charge Variants
PBZ分析中分离出5个电荷变体，排除了N-糖基化和C端Lys的影响。CE-MS/MS首次在加速迁移变体中鉴定到Asn⁵⁵琥珀酰亚胺中间体，在减速变体中检测到N端焦谷氨酸化和Asn脱酰胺，揭示CZE分离是多种PTM协同作用的结果。

结论与意义
该研究首次证实CZE-UV迁移率变化与特定PTM存在定量关联：焦谷氨酸化使净电荷减少导致迁移减速，而琥珀酰亚胺中间体的环状结构则显著增加迁移速度。建立的"分离-富集-鉴定"一体化策略，为生物药电荷异质性分析提供了新工具，尤其对生物类似药开发中关键质量属性(CQA)的监控具有重要价值。研究还发现CDR区(互补决定区)的Asn脱酰胺可能影响抗体结合活性，为优化生产工艺提供了分子层面的指导。法国团队Rabah Gahoual等通过这项研究，将CZE从单纯的分离技术升级为结构解析工具，推动了抗体分析技术向更高分辨率方向发展。