综述：三光子显微技术：深层活体脑成像的新兴技术

（编辑推荐）这篇综述系统阐述了三光子显微技术（3PM）如何突破双光子（2PM）成像深度限制，实现深层皮质及皮质下结构的高分辨率可视化，为神经环路（neural circuits）、胶质细胞（glial biology）、肿瘤-神经免疫互作等研究提供新工具，并探讨了其在神经科学领域的未来应用潜力。

　　

Abstract
理解大脑功能与病理机制需在完整神经环路中观察细胞动态。尽管双光子显微镜（2PM）革新了哺乳动物活体脑成像，但其成像深度局限于大脑皮层浅表区域。三光子显微镜（3PM）通过三光子激发（three-photon excitation）突破这一限制，以微创方式实现深部皮质（如第Ⅴ-Ⅵ层）和皮质下区域（如海马、丘脑）的高分辨率成像，为研究高阶脑功能的关键结构提供全新窗口。

技术原理与优势
3PM利用近红外（NIR）长波长（如1300 nm或1700 nm波段）激发荧光探针，通过三光子非线性吸收过程显著降低组织散射，成像深度可达1.6 mm（小鼠脑），是2PM的2-3倍。其独特优势包括：

1. 深层穿透：减少激发光在组织中的能量衰减，适用于研究杏仁核等情绪相关深部核团；
2. 高信噪比：通过抑制表层自发荧光，提升深层信号特异性；
3. 多色成像：兼容GCaMP6s（钙指示剂）和tdTomato（结构标记）同步观测神经元-胶质细胞互作。

神经科学应用

• 神经环路：首次在活体小鼠中记录到丘脑网状核（TRN）神经元在睡眠纺锤波期间的钙瞬变；
• 胶质生物学：揭示小胶质细胞（microglia）在阿尔茨海默病（AD）模型中对β-淀粉样斑块（Aβ plaques）的动态响应；
• 肿瘤微环境：观测到胶质母细胞瘤（GBM）侵袭前沿的肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）与神经元突触的物理接触。

挑战与展望
当前技术瓶颈包括长波长物镜设计、活体成像运动伪影校正等。未来方向涵盖：

1. 结合自适应光学（AO）补偿像差；
2. 开发靶向深部血管的荧光报告基因；
3. 拓展至非人灵长类脑研究。这项技术将持续推动对意识、记忆及神经退行性疾病机制的解析。