上呼吸道上皮单细胞图谱揭示细胞异质性及空间分布模式

研究人员针对上呼吸道上皮细胞异质性及空间分布模式不清的问题，通过单细胞RNA测序(scRNA-seq)结合空间验证技术，构建了小鼠上呼吸道(咽喉-气管支气管)上皮的单细胞图谱。研究鉴定出18种细胞类型，包括基底细胞(Trp63+)、分泌细胞(SCGB1A1+)和肌上皮细胞(ACTA2+)等，揭示了KRT6A/KRT17等角蛋白在稳态中的表达特征，并发现近端-远端轴线上club细胞的梯度差异。该研究为理解呼吸道疾病区域特异性提供了重要参考。

　　

呼吸系统作为人体与外界环境交互的第一道防线，其上皮组织的复杂性和功能性一直备受关注。然而，相较于下呼吸道的广泛研究，上呼吸道特别是咽喉部到气管支气管区域的上皮细胞组成和空间分布模式仍存在大量未知。这种认知空白直接影响了我们对喉炎、支气管炎等区域性呼吸道疾病发病机制的理解。传统观点认为，上呼吸道上皮主要由基底细胞、纤毛细胞和杯状细胞等有限类型组成，但近年研究发现，这些区域可能存在更精细的细胞分类和功能分工。特别是在稳态条件下，一些被认为只在应激状态下表达的角蛋白如KRT6A和KRT17的表达特征，以及不同解剖部位基底细胞的异质性等问题，都需要在单细胞分辨率下重新审视。

针对这些问题，加州大学圣地亚哥分校的研究团队在《iScience》发表了开创性研究。他们采用单细胞RNA测序(scRNA-seq)结合RNAscope空间验证的技术路线，对成年野生型C57BL/6小鼠的咽喉至气管支气管区域上皮进行了系统分析。研究团队首先通过流式细胞术分选上皮细胞(Epcam⁺CD31^-CD45^-)，然后使用10x Genomics平台进行单细胞测序，最终获得3,617个高质量上皮细胞的转录组数据。数据分析采用Seurat流程，通过UMAP降维和差异表达分析鉴定细胞亚群，并通过免疫荧光和原位杂交进行空间定位验证。

研究结果部分，文章首先在"单细胞转录组分析揭示上呼吸道上皮的区室化和细胞异质性"中发现，上呼吸道上皮可明确分为三个空间区室：Tmprss11a⁺的咽喉鳞状上皮、Nkx2-1⁺的气管支气管假复层上皮和Dmbt1⁺的粘膜下腺(SMG)上皮。通过RNAscope验证，证实这些标记物在各自区室中的特异性表达，如Tmprss11a在66%的咽喉细胞中表达，而Dmbt1在94%的SMG细胞中富集。

在"基因组分析揭示鳞状上皮沿基底-管腔轴的标志特征"部分，研究团队详细解析了咽喉鳞状上皮(SSE)的分层结构。他们发现基底细胞特异性表达Igfbp2，而基底和副基底层共表达Tmprss11a，角蛋白KRT13的表达则从基底延伸至管腔细胞并逐渐增强。特别值得注意的是，研究在咽喉顶端上皮中发现了一类散在分布的黏液分泌细胞，其特征性标志物为Il1a。

"沿近端-远端轴和基底-管腔轴角蛋白编码的系统分析"是该研究的亮点之一。研究人员在63种已知角蛋白基因中鉴定出21种在上呼吸道上皮表达的成员，建立了区域特异的"角蛋白代码"。通过免疫荧光验证发现，KRT8主要表达于气管假复层上皮和SMG上皮，而KRT14则富集于喉鳞状上皮和近端气管基底细胞。引人注目的是，传统认为的"应激诱导型"角蛋白KRT6A和KRT17在所有三个区室的基底细胞中均有表达，且在喉鳞状上皮和气管hillock结构中同时存在于基底和管腔细胞。

"基底细胞展现区域特异的转录组特征和功能特征"部分揭示了不同解剖部位基底细胞的异质性。研究发现喉基底细胞高表达细胞周期相关基因(Cdc20、Ccnb1等)，而气管基底细胞则富集炎症反应相关基因(Aqp5、Scgb3a2等)。特别有趣的是，SMG中的基底-肌上皮细胞(ACTA2⁺Trp63⁺)表现出独特的基因表达谱，包括轴突导向分子(Ntng1、Ntn4)和趋化因子(Cxcl12、Cxcl14)，提示其可能参与神经免疫调控。

对"粘膜下腺细胞异质性的单细胞解析"显示，SMG包含多种细胞类型：黏液-1细胞(MUC5B⁺)、黏液-2细胞(Lipf⁺)、浆液腺泡细胞(Bpifb5⁺)等。研究发现转录因子Nkx3-1特异性地表达于黏液-1、黏液-2和浆液腺泡细胞，而不存在于基底-肌上皮细胞，提示其在黏液细胞命运决定中的潜在作用。

最后在"沿咽喉-气管支气管轴的管腔细胞异质性"中，研究团队鉴定出三类club细胞：近端型(Slc6a15⁺)、中段型和远端型(Scgb1a1⁺Scgb3a2⁺)。免疫荧光证实远端club细胞的数量和标志物表达水平均显著高于近端区域。此外，研究还描述了神经内分泌细胞(Ascl1⁺Calca⁺)和tuft细胞(Pou2f3⁺Dclk1⁺)等稀有细胞群的空间分布特征。

这项研究通过构建高分辨率的空间转录组图谱，系统揭示了上呼吸道上皮的细胞组成和区域异质性。研究发现不仅证实了已知细胞类型的存在，还发现了新的亚群和分子标记，如Nkx3-1⁺的黏液细胞和Kcnj16⁺的立方状黏液细胞。特别重要的是，研究修正了传统观点，证实"应激