基于全细胞-核质分离RNA测序的转录本亚细胞定位精准量化方法研究

本研究通过开发新型贝叶斯回归模型，结合全细胞、核质分离RNA测序(RNAseq)数据，首次实现真核细胞转录本核质分布比例的精准计算。团队建立的定位指数(LI)模型突破传统FPKM比较法的局限，在模拟数据和ENCODE单细胞数据验证中显示优越性能，揭示保留内含子转录本核滞留机制及GC含量等序列特征与定位的关联，为基因表达调控研究提供新范式。

　　

在真核细胞中，RNA分子在细胞核与细胞质间的分布调控是基因表达的关键环节。核滞留可抑制蛋白质翻译，而胞质定位则促进蛋白合成。传统原位杂交技术通量低，计算预测模型依赖序列特征易忽略环境特异性调控。更棘手的是，常规核质分离RNA测序数据因测量基准不同（核质RNA总量未知），导致FPKM值无法直接比较——这正是制约亚细胞RNA定位研究的核心瓶颈。

巴塞罗那科学技术研究所的Vasilis F. Ntasis和Roderic Guigó团队在《NAR Genomics and Bioinformatics》发表创新性研究，通过数学推导证明：当同时具备全细胞、核质RNA测序数据时，可准确计算胞质RNA体积占比β，进而建立定位指数(LI)量化单个转录本的核质分布。研究利用Flux模拟器生成β值已知的基准数据集，结合ENCODE项目的11种细胞系数据，发现70-90%多聚腺苷酸化RNA位于胞质，并首次系统揭示不同转录本类型（如保留内含子转录本与蛋白编码转录本）的定位偏好性及其序列特征关联。

关键技术包括：1) 使用Flux模拟器生成含预设β值(0.5-0.8)的模拟RNAseq数据；2) 整合ENCODE项目中9种细胞系和2种原代细胞的匹配全细胞-核质RNAseq数据；3) 开发基于Stan的贝叶斯线性回归模型（误差项采用t分布），通过FPKM_w=(1-β)FPKM_n+βFPKM_c方程估算β值；4) 应用IRFinder和IPSA-NF分析内含子保留(IR-ratio)与外显子跳跃(PSI)事件。

理论模型构建
通过数学推导建立核心方程：FPKM_w(i)=(1-β)FPKM_n(i)+βFPKM_c(i)，证明β反映胞质RNA体积占比。如图1所示，当β偏离0.5时，传统"naive LI"(FPKM_c/(FPKM_n+FPKM_c))会产生显著偏差，而新模型能准确还原模拟设定的分布比例。

方法验证
在β值预设为0.5-0.8的模拟数据中，贝叶斯回归估算的β误差趋近于零（图2A），而传统方法误差随β偏离0.5显著增大（图2B）。单细胞数据测试显示，本方法估算β=0.82，更接近实验测量值0.84。

生物学发现

1. 转录本类型特异性：保留内含子转录本的LI中位数仅0.17，显著低于蛋白编码转录本（0.77）。NEAT1基因的不同异构体呈现核质异质性分布（图4B），证实定位是转录本而非基因属性。

1. 序列特征关联：核定位转录本具有更高GC含量（P<10^-15）和更短内含子（图4C），其核特异性外显子的低PSI值（<0.5）富集度达2.1倍（图4D），提示剪接效率与定位调控的耦合。

2. 跨细胞系保守性：72%的泛表达转录本（10细胞系）保持胞质定位一致性，显著高于条件特异性转录本（P<10^-6）。

这项研究建立的定量框架解决了核质RNA测序数据不可比的长期难题。发现定位调控具有转录本特异性（同一基因不同异构体可分布在不同区室），且受剪接效率与序列特征共同影响。技术层面，贝叶斯模型对测序深度降低的稳健性（10%数据量时误差仅0.01）使其适用于广泛数据集。生物学意义上，揭示核滞留可能是通过内含子保留实现调控的新机制，为理解神经肌肉疾病等RNA定位异常相关疾病的病理提供新视角。