基于CRISPR/Cas12a-DNAzyme/分裂适体级联反应的Septin9基因甲基化无标记检测新方法

《Biosensors and Bioelectronics》：CRISPR/Cas12a-Mediated DNAzyme/Split-Aptamer Cascade for Label-Free Detection of Site-Specific DNA Methylation

针对传统CRISPR/Cas12a检测系统依赖荧光标记探针导致的成本高、背景噪声大等问题，研究人员开发了一种基于DNAzyme和分裂DAP-10适体的级联无标记检测体系。该技术通过甲基化敏感酶AciI选择性消化非甲基化DNA，利用Cas12a激活后触发DNAzyme切割调控分裂适体重组，实现Auramine O荧光信号与甲基化水平正相关检测。在2-200 nM范围内线性优异（检测限1.74 nM），成功应用于结直肠癌筛查标志物Septin9的临床样本检测，为表观遗传诊断提供了高性价比解决方案。

在分子诊断领域，CRISPR/Cas12a系统因其兼具程序化核酸识别和非特异性单链DNA(ssDNA)反式切割能力而备受瞩目。然而传统检测方法依赖荧光标记探针，不仅合成复杂、成本高昂，还面临淬灭不完全导致的背景噪声问题。虽然G-四链体等无标记策略应运而生，但Cas12a对结构化DNA的切割效率低下，且信号与靶标浓度呈负相关，严重制约检测灵敏度。更棘手的是，低丰度靶标检测往往需要预扩增步骤，进一步增加了操作复杂性。

针对这些技术瓶颈，来自河南的研究团队在《Biosensors and Bioelectronics》发表创新成果。他们巧妙融合DNAzyme的催化特性和分裂适体的组装特性，构建了级联信号放大系统。该系统通过甲基化敏感酶AciI实现甲基化DNA的特异性识别，随后激活Cas12a切割DNAzyme，后者作为"分子开关"调控分裂DAP-10适体的重组，最终点亮荧光染料Auramine O(AO)。这种双级联放大机制不仅实现信号与靶标浓度的正相关响应，更将检测限推进至1.74 nM水平。

关键技术包括：1)甲基化敏感限制性内切酶AciI选择性消化；2)CRISPR/Cas12a系统靶向激活；3)DNAzyme介导的ssDNA连接子水解调控；4)分裂DAP-10适体重组诱导AO荧光增强。研究使用结直肠癌细胞系、临床组织和血液样本进行验证。

【Spectral Characterization of AO/DAP-10 Interaction】
通过光谱扫描确定AO/DAP-10复合物的最佳激发/发射波长为480/540 nm，为后续检测建立光学参数基础。

【Dose-response relationship between DAP-10 and fluorescence intensity】
在20 μM AO固定浓度下，0-1μM DAP-10呈现优异线性关系(R²=0.9974)，证实分裂适体系统的定量可靠性。

【Conclusion】
该研究突破性地将DNAzyme的催化功能与分裂适体的组装特性相结合，创建了"酶切-调控-重组"三级联放大通路。DNAzyme既作为Cas12a的反式切割底物，又作为连接子DNA的水解调节剂，这种双重角色设计显著提升信号转导效率。分裂DAP-10仅在连接子完整时才能重组并激活AO荧光，确保检测的高度特异性。

研究团队成功将该系统应用于结直肠癌筛查标志物Septin9的甲基化检测，在2-200 nM范围内展现良好线性，临床样本验证显示其区分甲基化状态的准确率达95%以上。这种无标记策略较传统方法降低成本约60%，且操作流程缩短至3小时内完成。

该技术的创新价值在于：1)首次实现Cas12a与DNAzyme的协同作用；2)建立正相关信号输出模式；3)免除预扩增步骤直接检测低浓度靶标；4)为表观遗传标志物检测提供通用平台。研究获得河南省自然科学基金等多项资助，相关成果已申请发明专利，为结直肠癌早筛提供了具有临床转化潜力的新工具。