新型耐热NAD+依赖性甲酸脱氢酶MkaFDH的发现及其在生物催化中的应用潜力

为解决工业酶在极端条件下稳定性不足的问题，研究人员从嗜热菌Methylacidiphilum kamchatkense Kam1中鉴定并表征了一种新型金属非依赖性NAD+依赖性甲酸脱氢酶（MkaFDH）。该酶在60°C高温和宽pH范围内保持催化活性，其kcat/Km达0.44 s?1mM?1，为生物修复和NADH再生系统提供了高效耐热工具。

　　

在生物技术和环境修复领域，甲酸脱氢酶（Formate Dehydrogenase, FDH）因其催化甲酸（HCOO^–）氧化为二氧化碳（CO₂）的能力而被广泛关注。这类酶在NADH再生、CO₂固定和药物合成中具有重要应用。然而，现有FDH普遍存在高温或极端pH下稳定性差的问题，限制了其工业潜力。例如，真菌来源的CtFDH和MtFDH虽可溶性强，但热稳定性不足；而金属依赖性FDH（如Rhodobacter capsulatus的酶）需严格厌氧条件，增加了应用复杂性。因此，寻找天然耐热且高效的FDH成为研究焦点。

为解决这一挑战，来自意大利的研究团队通过基因组挖掘和系统发育分析，从嗜热菌Methylacidiphilum kamchatkense Kam1中鉴定出一种新型FDH——MkaFDH。该研究通过生物信息学筛选18,850个FDH同源序列，结合ThermoBase数据库比对，锁定四种潜在耐热FDH，最终选择最适生长温度达55°C的MkaFDH进行实验验证。研究人员采用基因合成、大肠杆菌异源表达和镍柱纯化获得重组蛋白，并通过圆二色谱（CD）和酶动力学分析其特性。

关键实验技术
研究结合了基因组数据库挖掘（NCBI、ThermoBase）、多序列比对（Muscle、MAFFT）和系统发育树构建（IQ-TREE），从18,850个FDH同源序列中筛选目标酶。实验层面采用大肠杆菌BL21(DE3)表达系统、His-Trap亲和层析纯化，并通过紫外吸收法（340 nm监测NADH生成）测定酶活。热稳定性通过变温CD光谱和Boltzmann模型拟合评估，聚乙二醇（PEG）稳定效应通过时间-活性曲线验证。

MkaFDH的鉴定与结构特征
系统发育分析显示，MkaFDH与已知耐热FDH（如PseFDH）同源性达76.8%，但具有独特的N端富含脯氨酸的无序环，可能增强热稳定性。CD光谱证实其二级结构含23.4%α-螺旋和25%β-折叠，熔解温度（Tm）达60.15°C。值得注意的是，MkaFDH缺乏金属依赖性FDH中保守的金属结合位点（如H388/R588），表明其为典型的NAD⁺依赖性酶。

催化性能优化
在20 mM磷酸钠缓冲液（pH 8）中，MkaFDH对甲酸的K_m为2.05 mM，k_cat达0.90 s^?1，效率（k_cat/K_m）优于CtFDH（0.4 s^?1mM^?1）和MtFDH（0.04 s^?1mM^?1）。该酶严格依赖NAD⁺（K_m=0.68 mM），且Mn²⁺/Mg²⁺等金属离子不影响活性，印证其金属非依赖性。

极端条件下的稳定性
MkaFDH在57.5°C下保持100%活性，65°C完全失活，但添加10 mM PEG可使其在65°C保留部分活性（0.056 U/mg）。对比实验中，MkaFDH的Tm（60.15°C）接近PseFDH（63°C），远高于MtFDH（48°C）。这种稳定性与其序列中Ala替代Ser（如S131A/S184A）可能减少α-螺旋波动有关。

讨论与意义
该研究首次报道了源自极端嗜热菌的MkaFDH，其天然耐热性避免了复杂的蛋白质工程改造。相较于需突变提升稳定性的PseFDH（如S228A突变体），MkaFDH野生型即具备工业级热稳定性。其宽pH耐受性（pH 3.5-10）和PEG增强效应，使其适用于高温生物催化反应体系，如药物手性合成中的NADH再生。此外，低K_m值使其在低甲酸浓度环境中更具优势。

未来研究可探索MkaFDH的定向进化，例如引入类似PseFDH的Cys255突变以拓展其辅酶特异性至NADP⁺，满足合成生物学对NAPH再生的需求。该成果发表于《Current Research in Biotechnology》，为开发下一代耐热生物催化剂提供了新模板。