基因剂量依赖性转录因子Mkx在出生后肌腱发育与维持中的作用机制解析

本研究针对肌腱特异性转录因子Mohawk（Mkx）在出生后不同阶段的基因剂量效应展开深入探索。通过构建新型条件性敲除小鼠模型（MkxVenus-CreERT2/flox），结合时序性他莫昔芬诱导系统，首次揭示Mkx表达水平与肌腱厚度、胶原纤维排列的剂量依赖关系。RNA-seq分析发现ECM（细胞外基质）稳态相关通路异常，为肌腱退行性病变的靶向治疗提供了理论依据。

　　

肌腱作为连接肌肉与骨骼的关键力学传导组织，其精密的结构主要由I型胶原纤维束构成。这种特殊的细胞外基质（ECM）需要特定转录因子的精确调控，而Mohawk（Mkx）正是近年来被发现的肌腱特异性调控因子。尽管既往研究通过传统敲除模型证实Mkx对胚胎期肌腱发育至关重要，但出生后肌腱成熟阶段Mkx的动态作用机制仍存在两大谜团：一是Mkx在不同发育时期是否具有时序特异性功能？二是其表达剂量如何影响肌腱的长期维持？这些问题的解答对于理解肌腱退行性病变的分子机制具有重大意义。

东京科学研究所的研究团队在《Developmental Biology》发表的研究中，创新性地构建了双等位基因修饰小鼠模型：将Venus-CreERT2敲入等位基因与loxP侧翼的flox等位基因进行组合，实现了他莫昔芬诱导的时空特异性基因敲除。通过分别在出生后3天（P3）和6周龄两个关键时间点诱导Mkx缺失，结合透射电镜（TEM）超微结构观察和转录组测序（RNA-seq）分析，系统阐释了Mkx的剂量依赖性功能。

Establishment of Mkx Venus-CreERT2 knock-in mouse
研究团队采用CRISPR-Cas9技术，将Venus-CreERT2融合基因精准插入Mkx基因座的起始密码子区域。Venus作为增强型黄色荧光蛋白标记，CreERT2则赋予了他莫昔芬诱导的重组酶活性，为后续条件性基因操作奠定基础。

Animals
所有实验小鼠均采用C57BL/6J背景，通过交配Mkx^{Venus-CreERT2/+}与Mkx^flox/+品系获得三种基因型：野生型、单等位基因修饰型（Mkx^{Venus-CreERT2/+}）和双等位基因条件敲除型（Mkx^{Venus-CreERT2/flox}）。

Discussion
研究揭示Mkx存在显著的基因剂量效应：单等位基因缺失（Mkx^{Venus-CreERT2/+}）仅引起肌腱厚度轻微减少和胶原纤维排列轻度紊乱；而完全敲除（诱导后的Mkx^{Venus-CreERT2/flox}）则导致进行性肌腱结构恶化，表现为胶原纤维直径显著减小。TEM显示这种缺陷在出生后早期和成年期敲除组均存在，但动态变化轨迹不同。RNA-seq数据进一步发现，Mkx缺失主要影响ECM组织相关基因模块，包括多种胶原亚型的表达失调。

这项研究首次绘制了Mkx在肌腱终身维持中的剂量-效应关系图谱，证实即使成熟肌腱仍需要持续稳定的Mkx表达来维持结构完整性。该发现为肌腱修复再生提供了新的干预靶点，特别是针对年龄相关性肌腱退化或运动损伤的治疗策略开发具有重要指导价值。研究建立的时空特异性基因操作平台，也为其他结缔组织发育研究提供了方法学参考。