上调烟酰胺/烟酸单核苷酸腺苷酸转移酶增强巴西利什曼原虫前鞭毛体对氧化应激和锑剂的抗性

为解决利什曼病治疗中药物毒性及锑剂(Sb3+)耐药性问题，研究人员通过CRISPR/Cas9技术上调巴西利什曼原虫(L. braziliensis)的烟酰胺/烟酸单核苷酸腺苷酸转移酶(LbNMNAT)基因表达，发现该基因过表达可显著提升NAD/NADP水平，使寄生虫对H2O2和Sb3+的半数抑制浓度(IC50)升高，为靶向NAD代谢的抗利什曼药物开发提供新思路。

　　

利什曼病是由利什曼原虫引起的热带寄生虫病，全球每年有超过100万新增病例。尽管锑剂已使用80余年作为一线治疗药物，但耐药性问题日益严重，加之现有药物毒性大且缺乏疫苗，开发新靶点迫在眉睫。既往研究表明，寄生虫通过增加Trypanothione(T(SH)₂)来解毒锑剂，但NADPH依赖的再生系统作用尚不明确。而烟酰胺/烟酸单核苷酸腺苷酸转移酶(NMNAT)作为NAD合成通路的关键酶，可能通过调控NAD(H)/NADP(H)水平影响寄生虫的氧化应激抵抗能力，这一假说亟待实验验证。

来自中国的研究团队在《Experimental Parasitology》发表研究，利用CRISPR/Cas9系统对巴西利什曼原虫前鞭毛体的LbNMNAT基因进行5'端标记编辑，插入Crithidia fasciculata磷酸甘油酸激酶(CfPGKB)的5'UTR和mCherry报告基因。通过qPCR、Western blot、分子对接、NAD/NADP含量测定及氧化应激实验，系统评估了基因编辑效果及其表型影响。

3.1 Lbnmnat基因编辑验证
通过设计特异性sgRNA和含CfPGKB5'-mCherry的修复DNA模板，成功获得LbNTag编辑株。测序和PCR证实mCherry标签精准插入Lbnmnat基因5'端，且无脱靶效应。

3.2 转录稳定性提升
RT-qPCR显示编辑株的Lbnmnat/α-tubulin转录水平比野生型(LbWT)高2倍，证明CfPGKB5'UTR显著增强mRNA稳定性。

3.3 融合蛋白表达
Western blot检测到61.2 kDa的mCH-LbNMNAT融合蛋白，而内源LbNMNAT(33.7 kDa)因基础表达量低未被检出。

3.4 酶活性保留
分子对接显示mCherry标签未干扰Rossman折叠结构，NMN结合位点的氢键和π-π堆积作用与人类NMNAT1/3高度相似，预示酶功能完整。

3.5 代谢与抗性增强
编辑株NAD总量达野生型3倍，NADP提升1.5倍。氧化应激实验显示其对H₂O₂和Sb³⁺的IC₅₀显著升高，证实NAD合成上调直接增强抗氧化能力。

该研究首次通过基因编辑证实LbNMNAT在NAD合成和锑剂耐药中的核心作用。CfPGKB5'UTR的应用为低表达基因功能研究提供新工具。值得注意的是，NADPH可能通过再生T(SH)₂和谷胱甘肽(GSH)增强解毒能力，这为理解耐药机制开辟新视角。与疟原虫、血吸虫相关研究呼应，NAD代谢通路成为抗寄生虫药物开发的"阿喀琉斯之踵"。未来可进一步探索：①临床耐药株的Lbnmnat表达谱；②基因敲除的致死效应；③靶向NMNAT的小分子抑制剂设计。这项来自中国团队的工作，为对抗热带病提供了原创性理论基础和新技术路径。