典型海鲜基质中适配体结构稳定性与检测性能的干扰机制解析——以河豚毒素检测为模型

为解决复杂食品基质对适配体(aptamer)结构稳定性及检测性能的干扰问题，江南大学团队以河豚毒素(TTX)为靶标，系统研究了海鲜基质中蛋白质、离子强度对适配体A36和AI-52构象的影响。研究发现基质蛋白通过破坏A36稳定性并形成复合物阻碍其结合位点，而具有三迷你发夹结构的AI-52因结构稳定表现出更强抗干扰性。该研究首次阐明适配体结构稳定性是提升检测性能的关键，为复杂基质中aptasensor设计提供理论依据。

　　

河豚毒素（Tetrodotoxin, TTX）作为一种剧毒生物碱，其检测对海鲜食品安全至关重要。然而，海鲜中复杂的基质成分——如蛋白质、脂质和高盐环境——常常干扰传统检测方法的准确性。尤其当使用适配体（aptamer）这类单链核酸分子作为识别元件时，基质成分可能破坏其依赖特定折叠形成的三维结构，导致检测灵敏度显著下降。这一难题在检测小分子靶标时尤为突出，因为小分子通常通过"分子口袋"与适配体结合，而口袋的形成高度依赖精确的核酸折叠构象。

为系统解析海鲜基质对适配体性能的干扰机制，江南大学的研究团队设计了一项创新性研究。他们选取两种结构特征迥异的TTX适配体——线性结构的A36和具有三迷你发夹结构的AI-52，结合河豚、蛤蜊、贻贝和章鱼四种典型海鲜基质，通过多维度实验揭示了基质干扰的分子机制。研究发现，基质中的阳离子强度和蛋白质是干扰适配体功能的两大关键因素。在海鲜基质中，A36的检测限比缓冲体系升高2.8-29.7倍，而结构更稳定的AI-52仅升高2.3-6.6倍。这项发表于《Food Chemistry》的研究首次证实适配体结构稳定性与其抗基质干扰能力呈正相关，为复杂食品体系中aptasensor的优化设计提供了重要指导。

研究团队主要采用四种关键技术：圆二色谱（CD）分析适配体二级结构变化、等温滴定量热法（ITC）测定结合亲和力、荧光偏振实验验证蛋白质-适配体相互作用，以及构建基于SYBR Green I的荧光aptasensor评估实际检测性能。所有海鲜样本均经匀浆、离心等标准化前处理获得基质提取物。

Component analysis of typical seafood matrix
通过BCA试剂盒定量分析发现，河豚肝脏的蛋白质浓度高达12.3 mg/mL，显著高于肌肉组织（4.5 mg/mL）。阳离子检测显示所有基质均含Na⁺（120-350 mM）、Mg²⁺（5-15 mM）等金属离子，这些成分可能影响适配体静电相互作用。

Structural stability analysis of aptamers in binding buffer
CD光谱显示AI-52在280 nm处呈现典型正峰，表明其稳定迷你发夹结构；而A36的谱图随离子强度变化显著，提示构象灵活性。ITC测得AI-52对TTX的解离常数（K_d）为38 nM，优于A36的112 nM。

Mechanism of matrix interference on aptamer A36
基质蛋白（如分子量60 kDa的组分）与A36形成复合物，使荧光偏振值增加47%，直接阻碍TTX结合。CD证实基质使A36的负峰位移15 nm，表明其茎环结构破坏。

Anti-interference capacity of AI-52 in seafood matrix
即使在高蛋白基质中，AI-52的CD特征峰仍保持85%强度，且K_d仅增加1.8倍。分子对接模拟揭示其三重发夹结构通过空间位阻减少非特异性蛋白吸附。

Detection performance evaluation in real samples
构建的AI-52荧光传感器在河豚肝脏基质中检测限为0.21 μg/kg，较A36传感器（1.47 μg/kg）提升7倍。简单稀释（10倍）即可使AI-52性能恢复至缓冲液水平。

这项研究首次从分子层面阐明了海鲜基质干扰适配体功能的双重机制：阳离子环境破坏核酸二级结构，而蛋白质通过非特异性结合封闭靶标结合位点。更重要的是，发现具有刚性三级结构的适配体（如AI-52）通过减少构象波动和空间位阻效应，显著降低基质干扰。这一结论突破了传统仅依赖SELEX筛选抗干扰适配体的局限，提出了"结构稳定性优先"的新型设计策略。在实际应用层面，研究建议对于蛋白质含量>8 mg/mL的基质，可采用适配体AI-52结合样本稀释的联合方案，这对开发可靠的海鲜毒素现场检测技术具有重要实践价值。