朊病毒自发解聚效率低下：揭示淀粉样纤维碎片化机制的新证据

推荐：本研究针对朊病毒(PrPSc)自发解聚为二聚体/四聚体的争议性问题，通过多维度实验证实传统SEC技术存在基质结合假象，结合沉降速度离心(SV)和光散射分析发现PrPSc在去污剂处理后仍以>70聚体形式存在。该发现不仅调和了长达40年的学术争议，更为理解淀粉样纤维在细胞内的传播机制提供了关键依据。

　　

在神经退行性疾病研究领域，朊病毒(PrP^Sc)作为一类具有传染性的错误折叠蛋白，其复制和传播机制一直是科学界关注的焦点。过去40年间，关于PrP^Sc能否自发解聚为二聚体或四聚体等小寡聚体的研究存在严重分歧——部分研究声称在非变性去污剂中观察到完全解聚，而更多报道则显示PrP^Sc多聚体具有高度稳定性。这种矛盾直接影响到对朊病毒在宿主体内传播机制的认知：若自发解聚确实高效发生，则无需依赖细胞机制即可产生可传播单元；反之则说明宿主细胞的主动参与不可或缺。

为厘清这一根本问题，美国国立卫生研究院过敏与传染病研究所的Byron Caughey团队联合多个研究机构，在《Journal of Biological Chemistry》发表了突破性研究成果。研究人员选取啮齿动物适应的263K和22L朊病毒株作为模型，通过改良的溶解缓冲液(SB*)处理脑组织匀浆(BH)，结合多种正交技术系统评估了PrP^Sc的聚集状态。

关键技术方法包括：1) 尺寸排阻色谱(SEC)与多角度光散射(MALS)联用分析去污剂胶束干扰；2) 碘克沙醇梯度沉降速度(SV)离心评估颗粒大小；3) 300kDa超滤结合实时震动诱导转化(RT-QuIC)检测感染性单元；4) 负染透射电镜直接观察纤维形态；5) 细胞模型验证PrP^Sc在活体内的稳定性。实验样本来源于朊病毒感染的转基因小鼠(Tg7)和叙利亚仓鼠的终末期脑组织。

【结果】

1. DDM和sarkosyl处理对263K朊病毒的影响：
   通过改良的SB*配方(45mM DDM/80mM sarkosyl)处理263K感染的BH后，SEC洗脱曲线显示PrP^Sc主要出现在相当于66kDa牛血清白蛋白(BSA)的洗脱位置。然而超滤实验表明，这些"小分子量"组分中>99.97%的感染性被300kDa滤膜截留。SV离心进一步证实，洗脱峰中的PrP^Sc实际沉降速度远超665kDa标准蛋白，相当于70-100聚体。

2. 22L小鼠朊病毒的类似行为：
   在22L感染的鼠脑模型中，SEC洗脱的"小分子量"组分同样含有快速沉降的大颗粒。超声处理不仅未能减小颗粒尺寸，反而使部分PrP^Sc沉降更快，排除了人为解聚假象的可能性。

3. 无密度梯度的沉降分析：
   通过差速离心比较PrP^Sc与标准蛋白的沉降行为，发现12,500xg即可沉淀50%的PrP^Sc，而665kDa标准蛋白在此条件下仅沉降9%。数据拟合表明PrP^Sc颗粒平均质量为2.3-3.4MDa，且疏水相互作用可能使该估值偏小。

4. 光散射与质谱分析揭示关键假象：
   MALS检测发现SB*中的去污剂胶束(40-250kDa)与BSA洗脱位置重叠。当PrP^Sc浓度低至20nM时，胶束与假设的二聚体数量比高达12,000:1，说明既往研究的光散射信号主要来自胶束而非PrP^Sc。

5. SEC基质结合效应验证：
   在洗脱缓冲液中添加SB*后，PrP^Sc洗脱峰前移至31-42馏分(接近柱空体积)，证实其原本的延迟洗脱是由于与基质结合。树脂下拉实验直接显示去污剂可减少75%的PrP^Sc结合量。

6. 电镜直接观察：
   尽管20nM的低浓度使纤维难以寻找，负染电镜仍清晰显示SB*处理后存在数百纳米长的完整纤维，与自发解聚假说矛盾。

7. 细胞模型中的稳定性：
   将263K PrP^Sc导入缺乏PrP^C的CF10细胞24小时后，SV分析显示绝大多数PrP^Sc仍保持>665kDa的沉降特性，且内体蛋白酶抑制剂处理未改变此现象。

【结论与意义】
该研究通过多技术平台交叉验证，确证PrP^Sc在生理相关条件下不会自发解聚为二聚体/四聚体。SEC技术的假象源于：1) PrP^Sc大颗粒与基质的疏水结合；2) 洗脱过程中去污剂胶束的"冲刷"效应使颗粒虚假呈现小分子量行为。这一发现完美解释了40年来相互矛盾的研究报告，并将研究焦点转向细胞机制驱动的碎片化过程——如分子伴侣(Hsp70/Hsp110)、膜动力学、内体酸化等可能参与的调控途径。

在更广泛的神经科学背景下，淀粉样纤维(如α-synuclein、tau等)的传播可能遵循类似规律。研究提示针对宿主细胞碎片化机制的干预，比试图阻断根本不存在的"自发解聚"更具治疗前景。该成果为开发阻止朊病毒及类似蛋白聚集体传播的新策略奠定了理论基础。