基于LysP-CadC系统的动态调控策略显著提升大肠杆菌中尸胺生物合成效率

本研究针对微生物发酵生产尸胺(cadaverine)过程中前体赖氨酸(lysine)利用与细胞毒性平衡的关键瓶颈问题，开发了基于大肠杆菌Cad系统的pH非依赖性赖氨酸生物传感器。通过多级优化策略（关键位点突变CadCD471N/Y453I和启动子工程）将检测范围提升至200 mM，并应用于动态调控尸胺合成途径。在5 L发酵罐中实现33.19 g/L尸胺产量，较静态调控提升48.10%，为生物基聚酰胺单体生产提供了创新解决方案。

　　

在生物基材料领域，尸胺(1,5-二氨基戊烷)作为聚酰胺的关键单体具有广阔应用前景，但其生物合成面临严峻挑战。传统微生物发酵过程中，前体赖氨酸的利用与尸胺细胞毒性之间的失衡严重制约生产效率。当葡萄糖作为唯一碳源时，早期尸胺积累会破坏细菌孔蛋白功能，导致营养吸收障碍和生长停滞。虽然已有研究通过紫外诱变获得耐受菌株或采用温度开关两阶段发酵策略，但这些方法缺乏精准的动态调控能力。如何实现代谢通量的实时平衡，成为突破产量瓶颈的核心科学问题。

中国科学院微生物研究所的Mingjie Li、Shuwen Liu和Tingyi Wen团队在《Microbial Cell Factories》发表研究，创新性地利用大肠杆菌天然Cad系统开发赖氨酸响应型生物传感器。该系统由赖氨酸转运蛋白LysP、转录激活因子CadC和P_cad启动子控制的GFPuv报告基因构成。研究人员通过关键发现：酸性环境(pH<5.8)下，CadC与LysP解离并激活cadBA操纵子表达，将赖氨酸脱羧转化为尸胺。这种天然机制被巧妙改造为代谢调控工具。

研究采用多层级技术策略：通过CRISPR/Cas9系统进行基因编辑构建工程菌株；采用位点定向突变(CadC^D471N和CadC^Y453I)消除pH依赖性和尸胺反馈抑制；运用启动子工程(Anderson启动子库)优化LysP/CadC表达比例；通过HPLC监测代谢物浓度；利用微孔板读数仪定量GFPuv荧光强度评估传感器性能。菌株改造涉及MG1655背景下的cad系统敲除、关键基因过表达(lysC^T344M, dapA^H56K, ppc等)和代谢旁路阻断(△speE/△speG/△ygjG)。

构建和验证赖氨酸生物传感器

研究团队首先设计两种传感器构型：仅含CadC的Sensor-1和同时包含LysP-CadC的Sensor-2。实验证实Sensor-2能特异性响应10 mM外源赖氨酸，而Sensor-1呈现本底泄漏表达。通过引入CadC^D471N突变构建的Sensor-3，成功将工作pH范围扩展到中性条件(pH 7.6)，解决了工业发酵pH限制问题。该传感器在5-200 mM赖氨酸浓度区间呈现良好线性响应。

多级策略提升传感器性能

针对尸胺反馈抑制问题，引入CadC^Y453I突变(Sensor-4)使动态范围提升58%。进一步敲除染色体cad系统(Sensor-5)后动态范围扩大153%。通过启动子替换(P123109/P123114)精细调控LysP表达，最终获得的Sensor-7检测上限达200 mM，是目前大肠杆菌赖氨酸传感器的最高响应阈值。

尸胺生产菌株的代谢工程

构建的PDA系列菌株通过逐步强化代谢流：PDA-1过表达反馈抑制抗性基因lysC^T344M和lysA；PDA-2追加asd和dapA^H56K；PDA-3引入ppc增强PEP羧化。代谢旁路敲除实验显示，同时缺失speE/speG/ygjG的PDA-4△EGYP使摇瓶产量提升37%至11.69 g/L。

发酵罐动态调控验证

在5 L发酵体系中，采用Sensor-7动态调控的PDA-6菌株展现出显著优势：与组成型表达菌株PDA-5相比，生物量提升21.2%，尸胺产量达33.19 g/L（提高48.10%）。酶活分析显示动态调控下CadA活性降低45%，证实低水平表达即可满足需求。

该研究实现了三项重要突破：首次报道大肠杆菌赖氨酸生物传感器；开发出目前检测范围最宽(200 mM)的pH非依赖性传感器；通过动态调控使尸胺产量达到工业化相关水平。这种将天然应激响应系统改造为智能调控工具的策略，不仅为尸胺生产提供新范式，更为其他赖氨酸衍生物（如ε-聚赖氨酸、戊二胺等）的代谢工程提供普适性方法。研究揭示的"代谢流-细胞生长"动态平衡原理，对高价值化合物生物制造具有重要指导意义。未来通过定向进化优化CadC底物特异性，或可进一步拓展该传感器在合成生物学中的应用场景。