食用蘑菇因其营养丰富而广受欢迎，但褐斑病病原体托拉斯假单胞菌（Pseudomonas tolaasii）的侵染严重制约产业发展。传统检测方法如培养法耗时、PCR依赖精密仪器，难以满足现场需求。针对这一难题，中国农业科学院的研究团队在《Microchemical Journal》发表了一项创新研究，开发了基于重组酶辅助扩增（RAA）与CRISPR/Cas12a系统的一管式快速检测技术。

研究采用RAA等温扩增与CRISPR/Cas12a的协同作用，通过筛选亚优化PAM序列（protospacer adjacent motif）提升靶标结合效率，并设计荧光探针和侧流层析试纸条（LFD）实现双重可视化。实验样本包括托拉斯假单胞菌重组质粒及5种常见细菌（如铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌等）以验证特异性。

RAA优化
通过电泳筛选高效引物对F3-R1，确定最佳Mg²⁺浓度（200 mM）和反应温度（37–42°C），扩增产物为185 bp（图2A）。

一管式检测性能
整合LFD与荧光探针后，灵敏度分别达1.6×10^?6 ng/μL和1.6×10^?5 ng/μL，且能特异性区分托拉斯假单胞菌与其他细菌（图3）。

结论与意义
该技术将检测时间缩短至25分钟，无需复杂设备，通过物理分离RAA与CRISPR/Cas12a反应避免交叉干扰。其创新性在于利用亚优化crRNA实现一管式操作，为食用蘑菇病害的现场监测提供了高灵敏、高特异的解决方案，推动精准农业的发展。