多巴胺能神经元中MT1G激活揭示螯合剂与细胞毒性的关联及其在神经退行性疾病中的潜在作用

本研究针对帕金森病(PD)等神经退行性疾病的环境风险因素筛查难题，通过CRISP/R技术构建LUHMES MT1G::HiBiT报告细胞系，建立3D神经球qHTS平台，筛选LOPAC库发现49种MT1G激活剂（含45种螯合剂），揭示金属离子稳态失衡与神经元损伤的分子关联，为环境神经毒物鉴定提供新策略。

　　

背景与挑战
帕金森病(PD)发病率在过去150年间呈指数级增长，这种趋势无法用遗传因素解释，而是暗示环境毒物的累积效应。尽管流行病学已发现部分农药（如鱼藤酮、百草枯）与PD相关，但绝大多数环境风险因素仍未知。更棘手的是，传统神经毒理研究依赖表型观察，缺乏早期分子预警标志。Marcel Leist团队此前发现，七种神经毒物均可激活人源中脑多巴胺能神经元系(LUHMES)中金属硫蛋白基因MT1G的表达，这为开发敏感性生物标志物提供了突破口。

创新研究
为解决上述问题，来自国家药物筛选中心的研究团队通过CRISP/R技术在MT1G基因插入HiBiT荧光素酶标签，创建了LUHMES MT1G::HiBiT报告细胞系。结合3D神经球培养技术，建立了1536孔板定量高通量筛选(qHTS)平台，对1280种LOPAC化合物进行双指标（MT1G激活AC₅₀和细胞毒性IC₅₀）平行检测。

关键技术
研究采用四大核心技术：(1) CRISP/R介导的HiBiT标签精准插入MT1G基因外显子1；(2) 3D悬浮神经球培养延长神经元存活时间；(3) 纳米荧光素酶互补系统检测MT1G-HiBiT融合蛋白；(4) 多浓度梯度qHTS算法分析。实验验证阶段还测试了27种已知螯合剂，通过结构相似性聚类揭示构效关系。

重要发现

1. 基因工程验证
   PCR和Western blot证实HiBiT成功插入MT1G两个等位基因（图1）。硫丹（1μM）处理使报告基因活性提升1300倍，背景信号近乎为零，显示超高灵敏度。

2. 高通量筛选效能
   qHTS的Z'因子达0.44，AC₅₀重复性误差仅1.08倍（表2）。从LOPAC库中鉴定出49个MT1G激活剂，其中38个化合物的AC₅₀比IC₅₀低3倍以上，如二硫代氨基甲酸铵（AC₅₀=48nM vs IC₅₀=130nM）。

3. 螯合剂主导作用
   45种活性化合物（92%）具有金属螯合特征（图4），包括硫醇基、羧基等配体。特别值得注意的是，临床铁螯合剂去铁酮虽激活MT1G（AC₅₀=8.2μM）却无细胞毒性，而二硫化四乙基秋兰姆（IC₅₀=0.7μM）显示强毒性，提示螯合剂存在"双刃剑"效应。

4. 毒性机制启示
   27种已知螯合剂测试中，23种激活MT1G（图5），支持"螯合剂-金属离子失衡-氧化应激"级联假说。但例外如TPEN（强螯合剂）不激活MT1G，表明特定金属（如Zn²⁺）可能通过MTF1转录因子调控MT1G表达。

科学意义
该研究首次建立神经元特异性MT1G报告系统，突破传统毒理筛查的滞后性瓶颈。发现绝大多数MT1G激活剂为螯合剂，为环境暴露与PD发病的"金属假说"提供实验依据：某些螯合剂可能通过劫持酶辅因子中的金属（如线粒体复合物I的铁硫簇），诱发铁死亡(ferroptosis)或铜死亡(cuproptosis)。

应用前景
这套平台可扩展至ALS、MS等其它神经退行性疾病的环境因素筛查。未来或能通过MT1G激活谱建立"神经毒物指纹库"，为环境监管提供分子标尺。值得注意的是，14种非细胞毒性MT1G激活剂的发现，提示金属硫蛋白可能成为神经保护的药物靶点。

遗留问题
研究尚未阐明不同螯合剂对特定金属（Fe/Cu/Zn/Mn）的选择性是否决定其神经毒性强弱。此外，MT1G激活是金属过载的应激反应，还是螯合剂直接作用于MTF1转录因子，仍需深入机制探索。