基于CBT-Cys点击化学连接与妊娠试纸条联用的高灵敏核酸检测新方法

本研究针对传统酶促连接反应成本高、条件苛刻等问题，开发了一种基于2-氰基-6-氨基苯并噻唑（CBT）与胱氨酸（Cys-Cys）点击化学的非酶促连接方法，结合滚环扩增（RCA）和妊娠试纸条（PTS）技术，实现了甲型肝炎病毒（HAV）的高灵敏度检测（检测限3.2 fM）。该方法反应速率常数达13.82 M-1·S-1，为资源有限地区的便携式核酸检测提供了新策略。

　　

在分子诊断领域，核酸扩增技术如聚合酶链反应(PCR)和滚环扩增(RCA)已成为疾病筛查的核心工具。然而，传统酶促连接反应依赖昂贵的DNA连接酶，且需严格温控条件，限制了其在资源匮乏地区的应用。更棘手的是，现有检测技术多依赖大型仪器，难以实现现场快速检测。如何突破这些瓶颈？青岛科技大学的研究团队在《Analytica Chimica Acta》发表的研究给出了创新答案——他们巧妙地将生物正交点击化学与家用妊娠试纸条相结合，开发出一种无需酶的核酸检测新范式。

研究团队采用三项关键技术：首先利用CBT-Cys点击化学反应实现DNA末端高效连接（速率常数13.82 M^-1·S^-1），其次通过滚环扩增(RCA)指数级放大信号，最后创新性地采用双链DNA磁珠置换释放人绒毛膜促性腺激素(hCG)标记的ssDNA，借助妊娠试纸条(PTS)实现可视化读值。实验样本采用合成的HAV靶序列验证体系。

【Abstract】部分揭示，该方法通过质谱、凝胶电泳和PTS信号三重验证，成功构建了从化学连接到便携检测的完整链条。【Background】指出，相较于传统T4 DNA连接酶，CBT-Cys反应在常温下即可完成，且避免了线性副产物的生成。【Results】显示，优化后的体系对HAV检测线性范围跨越6个数量级（10.0 nM-10.0 fM），特异性显著。【Significance】强调该方法为POCT(床旁检测)提供了新思路，未来可结合智能手机图像识别实现自动化判读。

【Introduction】详细对比了各类点击化学反应的优势，指出CBT-Cys体系兼具Staudinger反应的温和性和CuAAC的高效性。【Section snippets】披露关键实验参数：使用10 kDa超滤离心装置纯化产物，phi29 DNA聚合酶完成RCA扩增。值得注意的是，【Conclusions】提出该平台可拓展至其他病原体检测，其非酶特性显著降低了冷链运输和储存成本。

这项研究的突破性在于：一是首次实现点击化学直接驱动RCA模板环化，二是将PTS的hCG检测机制创新性转化为核酸定量工具。正如【CRediT】所示，Xu Hun团队通过多学科交叉，为分子诊断提供了"无酶、无仪器"的新范式。该成果对传染病现场筛查具有重要价值，尤其适用于基层医疗机构和突发公共卫生事件应急检测。未来通过集成微流控技术，有望进一步缩短检测时间至30分钟以内。