新型噬菌体RNA聚合酶KpnP、Ro45Iw和CD23823的鉴定及其精确末端合成特性研究

本研究针对T7 RNA聚合酶(RNAP)在RNA合成中存在的3'端异质性和盐敏感性等问题，通过筛选噬菌体数据库，鉴定出三种新型RNAP（KpnP、Ro45Iw和CD23823）。研究发现这些酶在30°C下活性与T7相当，且CD23823具有更高盐耐受性；深度测序显示其能产生更均一的5'/3'末端序列，为RNA药物制备提供了新工具。

　　

RNA合成技术在生物医学领域应用广泛，但常用的T7 RNA聚合酶(RNAP)存在明显缺陷：其合成的RNA产物3'端存在异质性，可能产生免疫刺激性的双链RNA(dsRNA)，严重影响RNA药物的安全性；同时，T7 RNAP在高盐条件下活性显著降低，限制了其在体外翻译体系中的应用。虽然已有KP34、Syn5等替代酶被报道，但它们各有特性限制，无法完全取代T7 RNAP。为此，研究人员从噬菌体RNAP数据库中筛选新型酶，试图拓展RNA合成工具库。

研究团队首先通过NCBI数据库获取38种噬菌体RNAP序列，构建系统发育树后初筛9种酶。利用大肠杆菌无细胞表达系统(PUREfrex 2.0)进行活性检测，最终选定KpnP（源自Kleibsiella phage vB KpnP IME321）、Ro45Iw（源自Escherichia phage Ro45lw）和CD23823（源自Cronobacter phage Dev-CD-23823）进行深入研究。这三种酶的催化中心关键氨基酸（相当于T7的Asp⁵³⁷/Lys⁶³¹/Asp⁸¹²）完全保守，但序列相似度仅为23.7%-73.4%。

关键技术包括：1）通过系统发育分析和启动子预测软件(PhagePromoter Ver 0.1.0)鉴定启动子序列；2）利用定量PCR检测不同温度(16-44°C)和盐浓度(0-140mM K⁺ glutamate)下的RNA合成效率；3）采用深度测序(DNB-SEQ)分析5'/3'末端序列异质性；4）通过截断实验确定最小功能性启动子区域。

温度与盐耐受性表征
在30°C时，三种新RNAP的活性均高于T7，表明其更适应低温环境。CD23823在70mM K⁺ glutamate条件下活性提升，显示出独特盐耐受性，而其他酶活性随盐浓度增加而下降。

5'末端均一性分析
通过5'端适配体连接测序发现，Ro45Iw和CD23823的转录起始位点(+1位)分别为G和A，其主导序列占比达46%和60%，显著高于T7的28%。CD23823几乎不产生非模板G添加产物，表明其起始控制更精确。

3'末端精确性突破
3'端测序显示，T7 RNAP产物仅0.93%完全匹配模板末端，主要峰出现在+2nt位置（含自模板反应产物序列TCTCGGCATAGG）。而CD23823产物中29%完全正确，且主要峰位于理论终止位点(+0nt)，证明其几乎不发生自模板延伸。Ro45Iw在模板-10nt处因发夹结构出现意外终止峰，提示其过程性较弱。

最小启动子鉴定
通过截断实验确定三种RNAP的最小启动子：KpnP为5'-AATTAGGGCACACTATAGGGA，Ro45Iw为5'-ACTTAACTATCACTATAGGGA，CD23823为5'-AATGTATACCCCTATATACAC（下划线为+1位）。CD23823启动子结构与已知噬菌体类型均不同，属于新型分类。

这项研究首次系统表征了三种噬菌体RNAP的生化特性，其中CD23823展现出显著优势：其盐耐受性可适配体外翻译体系，末端合成精确性超越T7 RNAP近30倍，为tRNA/rRNA合成提供了无需核酶处理的解决方案。值得注意的是，这些酶在mRNA药物应用中的加帽效率、修饰核苷酸掺入能力仍需进一步验证。该成果不仅丰富了RNA合成工具箱，也为优化RNA治疗性产品的生产工艺提供了新选择，相关论文发表在《Journal of Biological Chemistry》上。