基于ARTP诱变与Box-Behnken设计联用技术提升解淀粉芽孢杆菌产杆菌霉素L的产量及其合成机制解析

本研究针对化学农药滥用引发的生态安全问题，通过大气室温等离子体(ARTP)诱变结合Box-Behnken设计优化培养基，显著提升解淀粉芽孢杆菌产杆菌霉素L的产量（244.22→676.47 mg/L），并揭示其通过σ因子调控合成及ABC转运蛋白(ytrBCC2DEF)促进分泌的分子机制。该成果为开发高效生物农药提供新策略，发表于《Microbial Cell Factories》。

　　

农业领域长期依赖化学农药防治病害，但由此引发的生态环境污染和食品安全问题日益严峻。开发高效、低毒的生物农药成为迫切需求。杆菌霉素L（Bacillomycin L）作为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）产生的环状脂肽，具有显著抗真菌活性，但其野生型菌株产量低制约工业化应用。传统基因编辑技术因细菌限制修饰系统效率低下，而大气室温等离子体(ARTP)诱变技术以其高效、低成本特性成为微生物育种的新选择。

为解决这一难题，来自四川大学等机构的研究团队通过ARTP诱变野生型菌株1841，获得遗传稳定的高产突变株M86，并结合响应面法优化培养基，系统解析了产量提升的分子机制。研究发现，突变株中σ因子（yplP/ykcP/cotJA）的失活解除对DegU转录抑制，激活杆菌霉素L合成基因簇(bmyABCD)表达；同时ABC转运系统(ytrBCC2DEF)基因上调促进脂肽外排。该成果不仅将杆菌霉素L产量提升至676.47 mg/L，还证实其对17种真菌和9种细菌的广谱抑制活性，为生物农药开发提供理论支撑。

研究采用四项关键技术：1) ARTP诱变结合抑菌圈筛选获得突变株M86；2) ESI-Q-TOF-MS鉴定C₁₄-C₁₆杆菌霉素L同系物；3) 全基因组重测序与转录组分析揭示σ因子及ABC转运蛋白突变；4) Box-Behnken设计优化甘氨酸、丝氨酸和K₂HPO₄浓度提升产量。

ARTP诱变筛选获得高产菌株
通过5-120秒梯度ARTP处理，以95%致死率为标准获得130株突变体。突变株M86抑菌圈直径较野生型扩大1.58倍，粗脂肽产量达985.17 mg/L，经40代传代验证遗传稳定性。

活性成分鉴定与合成机制
HPLC分离组分中，亚组分a2（含C₁₄-C₁₆杆菌霉素L）占粗提物42.21%。MS/MS检测到特征碎片离子b1(340.2593 m/z)和y5(188.0710 m/z)，证实其结构为β-AA-Asn¹-D-Tyr²-D-Asn³-Ser⁴-Glu⁵-D-Ser⁶-Thr⁷。转录组显示bmyABCD在M86中表达量较野生型提前12小时上调。

基因组突变与转运调控
重测序发现12个SNP和9个INDEL，其中σ因子家族基因(yplP/ykcP/cotJA)突变解除对DegU的抑制，促进bmyABCD转录；ABC转运基因簇ytrBCC2DEF表达量提升3.2倍，加速胞外分泌。

培养基优化实现产量突破
通过Plackett-Burman实验筛选关键因子，响应面法确定最佳配比：甘氨酸3.2 g/L、丝氨酸0.6 g/L、K₂HPO₄ 2.3 g/L。优化后产量达676.47 mg/L，较初始培养基提升1.63倍。

广谱抗菌活性验证
杆菌霉素L对链格孢菌（Alternaria alternata）等16种真菌及金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）等9种细菌具有抑制活性，尤其对灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）抑菌圈直径达28.6±1.2 mm。

该研究通过多组学联用技术，首次阐明ARTP诱变提升杆菌霉素L产量的双通路机制：转录调控增强合成能力与转运系统优化分泌效率。突变株M86的工业化应用将推动生物农药替代化学农药的进程，其研究方法为微生物次级代谢产物产量提升提供普适性策略。研究还拓展了杆菌霉素L在食品防腐和医药领域的应用前景，例如对耐药菌株的抑制作用值得深入探索。未来可通过合成生物学手段进一步改造菌株，实现脂肽类化合物的定向设计合成。