新型可裂解交联剂DiSPASO的开发及其在活细胞蛋白质相互作用研究中的应用

本研究针对现有可裂解交联剂在活细胞蛋白质相互作用(PPI)研究中存在的膜渗透性差、交联效率低等问题，开发了一种新型赖氨酸选择性交联剂DiSPASO。该试剂兼具MS可裂解性、炔基富集标签和优异膜渗透性，通过荧光显微镜和三种铜基富集策略验证其在Cas9、核糖体和活细胞中的适用性。研究为动态细胞环境中PPI网络的精准绘制提供了新工具，相关成果发表于《Communications Chemistry》。

　　

在结构生物学领域，解析蛋白质相互作用(PPI)网络如同破解生命活动的密码本。传统交联质谱技术(XL-MS)虽能捕捉蛋白质"社交关系"，但活细胞研究面临两大难题：交联剂难以穿透细胞膜，以及复杂细胞内环境中交联肽段鉴定率低。现有可裂解交联剂如DSBSO虽能简化质谱分析，但其带电基团严重限制细胞渗透性；而膜渗透性好的交联剂又缺乏高效的富集标签，导致低丰度交联肽被淹没在大量线性肽段中。这种"鱼与熊掌不可兼得"的困境，严重制约着科学家在原生环境中解析蛋白质三维结构和动态互作的能力。

维也纳大学等机构的研究团队在《Communications Chemistry》发表的研究中，设计出名为DiSPASO的"全能型"交联剂。这种分子巧妙整合四大功能模块：中央苯环提供结构稳定性、炔基标签实现点击化学富集、亚砜键赋予MS可裂解特性，以及NHS酯靶向赖氨酸残基。通过系统性优化，团队使其cLogP值(表征脂溶性)和拓扑极性表面积(tPSA)达到理想平衡，既保证膜渗透性又维持水溶性。令人惊喜的是，荧光显微镜显示DiSPASO能在5分钟内快速进入HEK 293细胞核，渗透速度远超传统交联剂。

研究采用三重技术路线验证DiSPASO性能：(1)基于吡啶基叠氮的IMAC富集策略；(2)二硫键生物素(ASSB)标记的链霉亲和素富集；(3)二硫键叠氮琼脂糖珠直接点击富集。关键创新包括开发15种理论双峰距离算法解析复杂裂解模式，以及MS Annika软件升级实现多双峰同步搜索。

合成与设计
通过七步高效合成路线，以克级规模制备DiSPASO核心中间体S5。Sonogashira偶联引入炔基后，经全局脱保护-NHS活化-氧化三步转化获得终产物。cLogP-tPSA分析显示其化学性质介于富集型与渗透型交联剂之间，完美平衡亲脂性与极性。

模型系统验证
在Cas9-Halo模型中，吡啶基叠氮富集使交联肽鉴定数提升17%，但总体效率仍比DSBSO低29-33%。质谱解析发现DiSPASO产生非典型裂解双峰(D11=208 Da，D12=226.01 Da)，揭示亚砜键在HCD过程中发生C-S键选择性断裂的新机制。

活细胞应用挑战
尽管显微镜证实DiSPASO高效渗透，但HEK 293活细胞交联仅鉴定到71个交联对。团队发现线性肽背景难以消除是主要瓶颈——即使120μL琼脂糖珠富集后，线性肽信号仍居高不下，表明现有富集策略对复杂样本的净化能力不足。

性能对比
与DSBSO相比，DiSPASO的细胞摄取速度提高6倍(5分钟vs 30分钟达峰)，但交联产率较低。这种"快渗透-低交联"现象可能源于单侧NHS酯水解导致的溶解度变化，提示需要优化反应活性与膜渗透性的平衡。

这项研究标志着可裂解交联剂设计的重大进步。DiSPASO的创新性体现在：(1)首次实现炔基富集、MS裂解与膜渗透的三重功能整合；(2)发现亚砜键在常规HCD条件下的非预期裂解行为，拓展了交联剂化学的理论认知；(3)建立的多种富集策略为复杂样本处理提供系统解决方案。虽然当前活细胞交联效率有待提升，但研究揭示的技术瓶颈(如线性肽干扰、交联剂稳定性)为下一代试剂开发指明方向。该成果不仅推动XL-MS技术在原生环境中的应用，也为研究弱/瞬态PPI、药物靶点发现等提供了新工具。正如作者强调，持续优化交联剂结构与算法匹配，将是实现"细胞全景互作图谱"梦想的关键。