新型药物诱导型CRISPRa/i系统实现基因转录的快速可逆调控

这篇综述介绍了基于突变人雌激素受体(ERT2)结构域与CRISPR激活/干扰(CRISPRa/i)系统融合的新型药物诱导型转录调控工具iCRISPRa/i。该系统通过4-羟基他莫昔芬(4OHT)诱导实现蛋白从胞质到核内的快速转位，具有诱导快速（4小时响应）、调控可逆（撤药后恢复）、剂量依赖和多基因协同调控等特点，其效率与组成型和强力霉素诱导型系统相当，但背景泄漏更低。该系统成功在多种细胞系诱导表型变化，为功能获得/缺失模型构建和基因治疗提供了更优选择。

　　

新型药物诱导型CRISPRa/i系统的开发

基因转录调控是生命过程的核心机制，传统CRISPR激活/干扰(CRISPRa/i)系统虽能通过失活Cas9(dCas9)与转录调控因子（如KRAB结构域或VP64-p65-Rta复合体）融合实现基因表达操控，但存在组成型激活导致的胚胎致死风险、脱靶效应累积等问题。研究团队创新性地将突变人雌激素受体(ERT2)结构域与CRISPRa/i组件融合，开发出4-羟基他莫昔芬(4OHT)诱导的iCRISPRa/i系统。通过优化ERT2的融合位点（N端双ERT2+C端单ERT2），该系统在HEK293T细胞中实现4小时内快速核转位，激活效率达非诱导系统的63.26%。

精准调控性能验证

该系统展现出三大核心优势：

1. 时空特异性：通过亚细胞定位分析证实，无4OHT时iCRISPRa/i被HSP90滞留在胞质，诱导后迅速入核；撤药3天内恢复基线状态。
2. 多场景适用性：在HEK293T细胞中激活内源基因Klf4表达达3.68倍，抑制Prdm4达22.2%；在NIH/3T3稳定株中诱导Fgf7上调4.7倍，Mstn下调55.27%。
3. 协同调控能力：sgRNA阵列可同步调控Il1rn/Klf4/Sox2（激活）或Prdm4/Canx/Hspb9（抑制），且效率与单基因相当。RNA-seq分析显示仅靶基因出现显著差异表达，脱靶率低于预测值。

生理功能调控实证

在黑色素瘤B16细胞中，iCRISPRa通过上调酪氨酸酶(Tyr)基因使黑色素含量增加50%；在C2C12成肌细胞中，iCRISPRi抑制肌融合关键因子Myomixer(Mymx)导致肌管融合指数下降16.8%，成熟指数降低39.6%。这些表型变化均严格依赖4OHT诱导，证实系统在复杂生理过程中的调控可靠性。

技术比较优势

相较于强力霉素诱导(TRE)系统，iCRISPRa/i具有更快的响应速度（4小时vs12小时）和更低的基础泄漏。其核转位机制避免了TRE系统持续表达导致的蛋白累积风险，为研究发育关键时间窗的基因功能提供精准工具。未来可通过优化ERT2融合策略拓展其在体应用，为基因治疗提供时空可控的新范式。