猴痘诊断新突破：CRISPR技术开启精准检测新时代

猴痘病毒(MPXV)的全球传播已成为重大公共卫生威胁，但其诊断面临两大难题：一是传统qPCR依赖昂贵设备，难以在资源匮乏地区普及；二是现有方法无法快速区分高致死率的Clade I（中非分支）与当前流行的Clade II（西非分支）。2023年中国疫情中，Clade II毒株占主导，但缺乏简便的分型工具制约了精准防控。

南京中医药大学附属南京第二医院精准医学中心团队在《Infectious Diseases of Poverty》发表研究，创新性地将多酶等温快速扩增(MIRA)与CRISPR-Cas13a系统结合，开发出超灵敏的MPXV检测技术。该技术通过靶向保守的F3L基因实现病毒检测，并基于C3L基因缺失特征建立分型方法，为猴痘防控提供了"一箭双雕"的解决方案。

关键技术方法
研究采用三步策略：1) 优化MIRA引物组（144 bp F3L基因扩增）；2) 筛选高效crRNA-3并优化CRISPR-Cas13a体系（1 μmol/L LwaCas13a+0.5 μmol/L crRNA）；3) 开发双模式检测：荧光法（FAM-BHQ1报告分子）和侧流层析试纸条法（FITC-生物素报告分子）。临床验证使用202例MPXV样本（含皮疹液、咽拭子等）和104例干扰样本（包括水痘-带状疱疹病毒等），qPCR作为金标准对照。

研究结果

1. 检测系统开发与验证
通过16组引物筛选确定F3R3组合扩增效率最佳（图1）。CRISPR-Cas13a系统经组分优化后，缺失任一要素（如T7 RNA聚合酶）均导致检测失败（图2e）。灵敏度测试显示可检出14.4拷贝/ml的合成质粒（图3b），且与牛痘、天花等正交痘病毒(OPV)无交叉反应（图3c）。

2. 临床性能验证
在202例临床样本中，该技术检出182例阳性（含qPCR漏检的3例高Ct值样本），与qPCR一致性达Kappa=0.994（表1）。侧流层析试纸条可肉眼判读Ct≤39的样本（图5），在32例验证中表现优异。104例干扰样本（如HIV、HBV等）均未出现假阳性（图4d）。

3. Clade分型体系
针对C3L基因缺失设计的PCR分型法可在40分钟内检测200拷贝/ml，20次重复阳性率100%（表4）。177例临床样本均鉴定为Clade II，与我国流行株匹配（表5），且与Clade I无交叉反应（补充表S9）。

结论与意义
该研究首次实现CRISPR-Cas13a技术与MIRA联用于MPXV检测，其优势在于：

1. 超灵敏性：14.4拷贝/ml的灵敏度优于常规qPCR，可检出qPCR漏检的低载量样本；

2. 双模式输出：荧光读数与试纸条结合，适配不同医疗场景；

3. 精准分型：填补了Clade快速鉴别技术空白，为流行病学追踪提供工具；

4. 现场适用性：无需复杂设备，37°C恒温反应，特别适合非洲等资源有限地区。

这项技术突破不仅为猴痘疫情防控提供了新武器，其模块化设计更为其他传染病检测提供了可借鉴的技术框架。未来通过开发"单管反应"体系，有望进一步降低操作门槛，推动CRISPR诊断技术的临床转化。