新型多重qPCR检测技术：特异性鉴别马链球菌兽疫亚种(S. zooepidemicus)与马链球菌马亚种(S. equi)

本研究针对马链球菌兽疫亚种(S. zooepidemicus)与马链球菌马亚种(S. equi)因97%基因同源性导致的鉴别诊断难题，开发了基于sodA、seeH和lacD基因的多重qPCR检测体系。该技术特异性达98%，检测限低至10-100拷贝/μL，为临床提供快速、经济且高灵敏的解决方案，显著优于传统培养法。

　　

马链球菌兽疫亚种(S. zooepidemicus)和马链球菌马亚种(S. equi)这对"近亲"细菌，在兽医临床中制造了不少麻烦。前者是机会致病菌，能引起马匹呼吸道疾病、子宫内膜炎甚至流产；后者则是高度传染性疾病"马腺疫"(Strangles)的元凶，全球每年造成严重经济损失。尽管两者致病性差异显著，但高达97%的DNA同源性让传统检测方法束手无策——培养法需2-3天且灵敏度低，现有PCR技术又依赖"排除法"间接判断。更棘手的是，两种细菌常混合感染，而目前缺乏针对S. zooepidemicus的特异性检测靶点。

来自英国研究团队在《Research in Veterinary Science》发表的研究，带来了突破性解决方案。研究人员从300份临床样本（含100份S. equi阳性、100份S. zooepidemicus阳性和100份阴性对照）出发，创新性地锁定三个关键基因：S. zooepidemicus特有的lacD基因（位于5kb缺失区）、S. equi独有的seeH毒力基因，以及两者共有的sodA基因。通过生物信息学分析和实验验证，开发出可独立运行或联用的多重qPCR检测体系。

关键技术包括：1) 基于lacD/seeH/sodA基因设计特异性引物探针；2) 使用300份临床样本验证（来源：Animal Health Trust和Rossdales Laboratories）；3) 建立98%特异性的检测标准；4) 灵敏度测试（10-100拷贝/μL）。

【阳性对照材料与临床样本】
研究采用6株S. equi参考菌株和94份临床样本（含咽囊冲洗液、鼻洗液等），以及8株S. zooepidemicus参考菌株和92份临床样本，确保检测体系的广泛适用性。

【新型引物设计】
通过序列比对发现，S. equi特有的seeH基因（编码内毒素）和S. zooepidemicus的lacE-F-T基因簇缺失区域，为特异性检测提供理想靶点。BLAST分析证实引物无交叉反应。

【引物特异性评估】
实验显示，针对seeH和lacD的引物仅对目标菌株起反应，与马源β-溶血链球菌等近缘种无交叉，克服了传统ICE元件检测可能出现的假阳性问题。

【讨论与结论】
该研究首次实现S. zooepidemicus的直接特异性检测，打破既往依赖排除法的局限。检测限达10-100拷贝/μL，可识别培养法易漏诊的低载量感染。相较于Alber等(2004)的两步PCR法和Cordoni等(2015)的ICE靶向检测，新方法将鉴别诊断缩短至单次反应，且规避了可移动遗传元件(如phiSeq4噬菌体)带来的假阳性风险。

研究团队特别指出，lacD基因在S. zooepidemicus中的保守性使其成为稳定靶点，而seeH基因虽位于phiSeq4前噬菌体上，但在S. equi中呈现高度特异性。这种"双靶点+内参"的设计思路，为动物病原体快速诊断提供了新范式。该技术已具备商业化转化条件，对马业疾病防控和公共卫生监测具有重要价值。