工程化T7 RNA聚合酶级联系统：乳球菌中基于乳链菌肽和茶碱调控的蛋白质过表达与靶向基因诱变新策略

为解决乳球菌(Lactococcus lactis)中NICE系统转录效率低和缺乏连续基因诱变工具的问题，研究人员通过整合T7 RNA聚合酶(T7RNAP)和茶碱依赖型核糖开关(RbxE)，开发了NICE-T7表达系统和MutaT7LL诱变系统。该系统使GFP表达提升2.8倍，并实现1.33×10?6的A-to-G突变效率，为乳球菌的蛋白生产和定向进化提供了创新平台。

　　

在食品工业和生物制药领域，乳球菌(Lactococcus lactis)因其安全性和高效蛋白分泌能力被广泛用于异源蛋白生产。然而，其核心表达工具——乳链菌肽调控基因表达系统(NICE)依赖宿主RNA聚合酶，转录效率低下；同时，该菌种缺乏实现连续基因诱变的工具，限制了其在合成生物学和蛋白质工程中的应用。

为解决这些瓶颈问题，中国科学院的研究团队在《Synthetic and Systems Biotechnology》发表研究，通过整合高活性的T7 RNA聚合酶(T7RNAP)和茶碱依赖型核糖开关(RbxE)，开发了升级版NICE-T7系统。研究人员采用流式细胞术(FACS)筛选核糖开关突变体，通过qRT-PCR和荧光检测评估表达效率，并融合腺苷脱氨酶(TadA8e)构建了MutaT7LL诱变系统。

T7RNAP在E. coli中的泄漏表达毒性
研究发现，NICE系统的PnisA启动子能被E. coli RNA聚合酶识别，导致T7RNAP泄漏表达引发质粒突变。通过比较J23105/J23102启动子活性，证实PnisA在E. coli中具有基础转录活性。

茶碱依赖型核糖开关的优化
引入RbxE核糖开关后，PnisA泄漏表达降低70%。通过定向诱变核糖开关茎环-RBS区间，获得突变体Prem4，使T7RNAP在乳球菌中的诱导表达提升2.4倍，同时维持E. coli中的严格调控。

NICE-T7系统的性能评估
优化后的系统使GFP表达量提升2.8倍，qRT-PCR显示gfp转录水平增加3.89倍。该系统在11.3 nM乳链菌肽和5 mM茶碱诱导下无细胞毒性，且能适应低浓度诱导剂。

MutaT7LL系统的靶向诱变能力
融合TadA8e的T7RNAP成功将ermB基因的终止密码子TAG回复突变为TGG，获得1.33×10^?6的 erythromycin抗性频率，测序证实了精准的A-to-G编辑。

该研究创新性地将正交调控元件与高效转录机器结合，突破了乳球菌蛋白生产的瓶颈。NICE-T7系统通过双诱导策略实现表达精细调控，MutaT7LL系统则填补了该菌种连续进化的技术空白。未来通过引入胞嘧啶脱氨酶等改造，可进一步扩展突变谱系，为乳酸菌合成生物学和疫苗开发提供强大工具。