真核生物Argonaute蛋白CsAgo的体外可编程DNA切割能力及其在基因操作工具开发中的应用

本研究首次报道了来自嗜热真菌Chaetomium sp.的真核Argonaute蛋白(CsAgo)具有DNA/RNA双向导的DNA切割能力。研究人员通过系统表征发现，CsAgo能在20-90°C宽温域内实现ssDNA/dsDNA和RNA的可编程切割，并基于此开发了高灵敏度(6拷贝/反应)的核酸检测方法和简化克隆流程的新技术，为基因操作提供了新型工具。该成果发表在《Nucleic Acids Research》。

　　

在生命科学领域，基因操作技术的革新始终是推动研究进展的核心动力。传统CRISPR-Cas系统虽然强大，但其依赖特定序列(PAM)的特性限制了靶向范围。与此同时，原核Argonaute(pAgo)蛋白虽展现出DNA切割潜力，但真核Argonaute(eAgo)长期以来被认为仅能切割RNA。这种认知局限阻碍了eAgo在基因操作中的应用开发。来自湖北大学的研究团队通过挖掘嗜热真菌资源，发现了一个打破常规的真核Argonaute蛋白——CsAgo，其独特的温度适应性切割特性为基因操作工具箱增添了新成员。

研究团队采用多学科技术手段系统解析了CsAgo的功能特性。通过生物信息学分析筛选目标蛋白后，利用大肠杆菌表达系统进行重组蛋白制备，采用镍柱亲和层析和肝素层析两步纯化获得高纯度蛋白。通过体外核酸切割实验系统评估了不同温度、pH、离子浓度等条件下的酶活特性。借助荧光标记的寡核苷酸底物和琼脂糖/聚丙烯酰胺凝胶电泳分析切割效率。针对dsDNA切割优化时引入了多种单链DNA结合蛋白(SSB)进行功能增强。基于切割特性开发了分子克隆和核酸检测应用平台。

研究结果部分包含以下重要发现：

Guide-mediated endonucleolytic cleavage of ssDNA and RNA by CsAgo
研究发现CsAgo能利用四种向导分子(5'P-gDNA、5'OH-gDNA、5'P-gRNA、5'OH-gRNA)切割靶核酸。在85°C、pH 10、Mg²⁺条件下，5'P-gDNA介导的DNA切割效率最高，切割位点位于向导第10-11位核苷酸。值得注意的是，这是首次发现eAgo具有DNA切割能力。

CsAgo's optimal DNA cleavage conditions with gDNA differ from other guide-target pairs
温度梯度实验揭示CsAgo具有惊人的温度适应性：gDNA介导DNA切割在49-95°C有效(最佳79-89°C)；gRNA介导DNA切割在15-50°C有效；而RNA切割在20-90°C均有效。这种宽温域活性使其在不同应用场景中都具有实用价值。

The guide sequence affects CsAgo activity
向导长度优化显示：DNA切割最佳向导长度为15-21nt(5'P-gDNA)或16-19nt(5'OH-gDNA)。值得注意的是，≥20nt的5'OH-gDNA会产生多切割位点。此外，CsAgo对5'-嘌呤向导表现出明显偏好，这与大多数eAgo特性一致。

gDNA-directed cleavage of plasmid and linear dsDNA
突破性发现CsAgo能在≥80°C切割dsDNA。使用配对向导时，CsAgo可线性化质粒；单向导也能产生切口。GC含量影响显著，在≤45% GC区域效率最高。来自Caldanaerobacter subterraneus的SSB蛋白(CaSSB)能显著增强线性dsDNA切割效率。

CsAgo-mediated molecular cloning
应用实验证明，基于CsAgo的分子克隆方法能精确产生粘性末端，实现多片段组装。在sfGFP单片段克隆中，60个克隆中有58个正确；在sfGFP+mCherry双片段克隆中，30个克隆有28个正确，显示出极高的准确率。

CsAgo can be repurposed for sequence-specific DNA detection
开发的CsAgo核酸检测方法灵敏度达6拷贝/反应，与qPCR相当。通过设计向导可特异性区分单核苷酸多态性(SNP)，在向导2-13nt区域引入错配即可显著降低信号。

这项研究从根本上改变了人们对真核Argonaute蛋白功能的认知，证明eAgo同样具备DNA切割能力。CsAgo独特的温度适应性使其在不同应用场景中展现出优势：中温区(30-50°C)的RNA向导DNA切割可能用于基因编辑；高温区(>80°C)的DNA向导DNA切割适合分子克隆等操作。所开发的核酸检测方法灵敏度与qPCR相当，但操作更简便；而分子克隆技术则突破了传统限制酶的序列限制，实现了真正意义上的"任意位点"切割。这些发现不仅拓展了对Argonaute蛋白进化与功能的理解，更为基因操作和分子诊断提供了新型工具，具有重要的理论和应用价值。未来研究可进一步优化CsAgo的切割效率，探索其在真核细胞内的应用潜力，推动这一新型工具向更广阔的领域发展。